Um protocolo simples para a preparação de extractos de tecido humano para ser usado como uma fonte de antigénios de células T funcionais de ensaios está descrito. Este método permite a respostas das células T aos antigénios derivados de tecido a ser medido In vitro.
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Artigo de método
Extracção do Tissue Antigens para Ensaios Funcionais
Neste artigo
Resumo
Resumo
Muitos dos alvos de antigénio de resposta imune adaptativa, reconhecidos por células T e B, não foram definidas 1. Isto é particularmente verdadeiro em doenças auto-imunes e cancro 2. O nosso objectivo é o de investigar os antigénios reconhecidos pelas células T humanas do tipo de doença auto-imune uma diabetes 1,3,4,5. Para a análise de células T humanas respostas contra o tecido, onde os antigénios reconhecidos pelas células T são identificadas não foi desenvolvido um método para extrair os antigénios de proteína a partir de tecido humano, em um formato que é compatível com ensaios funcionais 6. Respostas previamente, de células T para extractos de tecido não purificados não puderam ser medidos por métodos de extracção de produzir um lisado que continha detergentes que foram tóxicas para as células mononucleares do sangue periférico. Aqui descrevemos um protocolo para a extracção de proteínas a partir de tecidos humanos, em um formato que não é tóxico para as células T humanas. O tecido é homogeneizado numa mistura de butan-1-ol, acetonitrilo e water (BAW). A concentração de proteína no extracto de tecido é medida e uma massa conhecida de proteína é separado em alíquotas para tubos. Depois da extracção, os solventes orgânicos são removidos por meio de liofilização. Extractos de tecidos liofilizados podem ser armazenados até serem necessários. Para utilização em ensaios da função imune, uma suspensão de células do sistema imunológico, em meios de cultura apropriados, podem ser adicionados directamente ao extracto liofilizado. A produção de citocinas e a proliferação de PBMC em resposta a extractos preparados utilizando este método, foram facilmente medido. Por isso, o nosso método permite a preparação rápida de lisados de tecido humano que podem ser utilizados como uma fonte de antigénios na análise de respostas de células T. Sugerimos que este método irá facilitar a análise das respostas imunes adaptativas para os tecidos em transplantes, cancro e auto-imunidade.
Protocolo
1. Preparando tecido do baço
- Nota-todo o material humano devem ser tratados como potencialmente infecciosos e todos os procedimentos devem ser realizados em uma Capela Fluxo Laminar Classe II. Usando tesouras e pinças esterilizadas, remover gordura e tecido fibroso de seções do baço (~ 1-2 cm de tamanho) e retire o máximo de material da cápsula externa possível.
- Corte um pedaço pequeno (1-2 cm 3) de tecido do baço e colocar cada peça em um tubo de 50 ml estéril Falcon.
- Snap-congelar os pedaços de tecido por imersão em N2 líquido.
- Armazenar a -80 ° C. Um protocolo similar é adequado para qualquer outro tec....
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Discussão
Este protocolo foi desenvolvido porque queríamos gerar um extrato de tecido humano que estava livre de produtos químicos tóxicos como detergentes. Especificamente utilizou-se para preparar os extractos de tecido humano que podem ser utilizados em ensaios de função imunitária humana, in vitro. Extractos preparados utilizando este protocolo pode igualmente ser reconstituída em qualquer tampão e usados para muitas análises bioquímicas, tais como cromatografia de Western blotting ou líquido. Isto faz com.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado por concessões do Australian Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho (NHMRC # 559007) eo Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) e do Sistema de Infra-estrutura Operacional do Governo de Victoria. Agradecemos aos membros da Islet Mandel Tom Programa de Transplante Equipe Isolamento Islet para a prestação dos tecidos humanos. Tecidos humanos foram coletadas e utilizadas com aprovação ética local (Hospital São Vicente HREC-A 011/04 e de Saúde de São Vicente HREC-A 135/08).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| 5 ml 12 x 75 mm tubos de polistireno estéreis | BD Falcon | 352054 | |
| Tampas para tubos de tubos de poliestireno (acima) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml tubos estéreis | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrila | Chemicals Mallinckradt | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogeneizador: PRO200 | Bio-estratégia | 01-01200 | 10 x 115 mm gerador de dente de serra |
| Liofilizador | Virtis, bancada 4K | ||
| Agulha estéril calibre 18-20 | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Meio | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 |
Tabela 1. Reagentes específicos e de equipamento.
Referências
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identificat....
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Reimpressões e permissões
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