Een analytisch instrument dat cellulaire morfologie Veranderingen van Drie-dimensionale Fluorescentie afbeeldingen kwantificeert
Summary
Wij ontwikkelden een software platform dat Imaris Neuroscience, ImarisXT en MATLAB om de veranderingen in morfologie van een ongedefinieerde vorm uit driedimensionale confocale fluorescentie van afzonderlijke cellen te meten gebruikt. Deze nieuwe benadering kan worden gebruikt om veranderingen in celvorm na receptor activatie kwantificeren en dus een mogelijke extra hulpmiddel voor drug discovery.
Abstract
De meest voorkomende software-analyse tools beschikbaar voor het meten van fluorescentie beelden zijn voor twee-dimensionale (2D) gegevens die afhankelijk zijn van handmatige instellingen voor in-en uitsluiting van datapunten, en computer-aided patroonherkenning om de interpretatie en bevindingen van de analyse te ondersteunen. Het is steeds belangrijker kunnen fluorescentiebeelden opgebouwd uit driedimensionale (3D) datasets meten om te kunnen de complexiteit van cellulaire dynamiek vangen en de basis van cellulaire plasticiteit in biologische systemen begrijpen. Geavanceerde microscopie instrumenten toegestaan de visualisatie van 3D-fluorescentie beelden door de overname van multispectrale fluorescentie beelden en krachtige analytische software die de beelden reconstrueert van confocale stapels die vervolgens zorgen voor een 3D-weergave van de verzamelde 2D-beelden. Geavanceerd ontwerp op basis van stereologie methoden zijn gevorderd van de harmonisatie en veronderstellingen van de oorsprongl modelmatige stereologie 1 zelfs in complexe weefselcoupes 2. Ondanks deze wetenschappelijke vooruitgang in microscopie, een behoefte bestaan aan een geautomatiseerde analytische methode die volledig gebruik van de intrinsieke 3D data, teneinde de analyse en kwantificering van de complexe veranderingen in celmorfologie, eiwit lokalisatie en receptor handel.
Huidige technieken om fluorescentie te kwantificeren beelden omvatten Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) en Image J (NIH) die handmatige analyse. Imaris (Andor Technology, Belfast, Noord-Ierland)-software biedt de functie MeasurementPro, waarin het handboek creëren van meetpunten die kunnen worden geplaatst in een volume afbeelding of getekend op een reeks van 2D plakken tot een 3D-object te maken mogelijk maakt. Deze methode is bruikbaar voor een klik puntmetingen een lijn tussen twee objecten meten of een veelhoek die een van belang omvat maken, maar het is moeilijk toepasbaar op complex mobiele netwerk structuren. Filament Tracer (Andor) maakt automatische detectie van de 3D neuronale filamentachtig echter deze module is ontwikkeld om gedefinieerde structuren zoals neuronen, die bestaan uit dendrieten, axonen en stekels (boomstructuur) te meten. Deze module ingenieuze is gebruikt om morfologische metingen niet-neuronale cellen 3 te maken, maar de uitvoergegevens informatie van een uitgebreid cellulaire netwerk via een software afhankelijk is van een bepaalde celvorm plaats van een amorfe vorm van cellulaire model. Om het probleem van het analyseren van amorf-vormige cellen en het maken van de software meer geschikt is om een biologische toepassing te overwinnen, Imaris ontwikkeld Imaris Cell. Dit een wetenschappelijke project de Eidgenössische Technische Hochschule, die is ontwikkeld om de relatie tussen cellen en organellen berekenen. Terwijl de software kan de detectie van biologische beperkingen Het dwingt een kern per celen met celmembranen segment cellen kan niet worden gebruikt om fluorescentie gegevens zijn niet permanent omdat idealiter gebaseerd celoppervlak zonder lege ruimten analyseren. Voor zover ons bekend, op dit moment geen door de gebruiker aanpasbaar geautomatiseerde aanpak die morfometrische informatie geeft van 3D fluorescentie beelden ontwikkeld die zorgt voor cellulaire ruimtelijke informatie van een ongedefinieerde vorm (figuur 1).
We hebben een analytische platform met behulp van de Imaris kern software module en Imaris XT gekoppeld aan MATLAB (Mat Works, Inc.) Deze hulpmiddelen kunnen de 3D meting van cellen zonder een vooraf gedefinieerde vorm en inconsistente fluorescentie netwerkcomponenten. Bovendien zal deze methode kunnen de onderzoekers die kennis uitgebreid in biologische systemen, maar niet vertrouwd zijn met computer-toepassingen, voor kwantificering van morfologische veranderingen uit te voeren in cel dynamiek.
Protocol
Discussion
We toonden aan dat CRF behandeling een significante verandering in de morfologie en de locatie van CRF-R2 geïnduceerd. De verandering in CRF-R2 werd geremd door selectieve antagonisten. We toonden aan dat receptor wijzigingen niet werden gedetecteerd en kan worden gemeten met de standaard 2D multispectrale technieken. De mogelijkheid om complexe 3D beelden bestuderen is kritisch voor de complexiteit van biologische parameters bevatten voor morfometrische analyse. We waren in staat om 3D-metingen van cellen te maken zon…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de Biologische Imaging Development Center (BIDC) University of California, San Francisco voor het gebruik van de Imaris, Imaris XT en Matlab. Wij danken V. Kharazia voor de technische bijstand en AT Henry, LK Floren, L. Daitch voor hun bijdragen aan de redactie van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door financiering van de staat Californië Medical Research on Alcohol & Substance Abuse door UCSF aan SEB, de National Institutes of Health: 1R21DA029966-01 en NIH Fast Track gunning aan de MLSMR collectie screenen aan SEB, UCSF School of Pharmacy ( Decanaat en Klinische Farmacie) en de School of Medicine (Klinische Farmacologie & Experimental Therapeutics) naar CLHK.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
Referências
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262 (2009).
- Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
- Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
- Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
- Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
- Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
- Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).
