三次元蛍光画像から細胞形態の変化を定量分析ツール
Summary
我々は、単一細胞の三次元共焦点蛍光から取ら未定義形状の形態の変化を測定するためにImaris神経科学、ImarisXTとMATLABを利用したソフトウェアプラットフォームを開発しました。この新しいアプローチは、受容体活性化に続く細胞形状の変化を定量化するため、創薬のための可能な追加ツールを表すために使用することができます。
Abstract
蛍光画像を測定するための最も一般的なソフトウェア分析ツールは、2次元（2D）のデータポイントの包含と除外のためのマニュアル設定に依存するデータ、分析の解釈と所見をサポートするためにコンピュータ支援パターン認識のためのものです。それは、細胞ダイナミクスの複雑さをキャプチャし、生物系内の細胞の可塑性の基礎を理解することができるようにするために、3次元（3D）データセットから構成され、蛍光像を測定することができるようにすることがますます重要になってきている。洗練された顕微鏡の楽器は、マルチスペクトル蛍光画像の取得と、収集した2D画像の3D表現を提供する共焦点スタックから画像を再構成する強力な解析ソフトウェアを介して3次元蛍光画像の可視化を許可されています。先進的なデザインをベース立体学法は、原送信の近似や仮定から進展している複雑な組織切片でも2リットルモデルベースの立体学1。顕微鏡でこれらの科学的進歩にもかかわらず、必要性が完全に細胞形態、タンパク質の局在化と受容体の輸送の複雑な変化の分析と定量化を可能にするために本質的な3Dデータを活用して自動化された分析方法のために残してあります。
蛍光画像を定量化することが可能な現在の技術は、メタモーフ（Molecular Devices社、米国カリフォルニア州サニーベール）とマニュアル分析を提供する画像J（NIH）を含む。 Imaris（アンドール·テクノロジー、ベルファスト、北アイルランド）ソフトウェアは、ボリューム·イメージに入れたり、3Dオブジェクトを作成するには、2Dスライスのシリーズで描くことができる測定ポイントの手動作成を可能にする機能MeasurementProを提供します。このメソッドは、2つのオブジェクト間のラインの距離を測定したり、関心のある領域を囲むポリゴンを作成するためにシングルクリックポイント測定に便利ですが、それはCOMPLに適用することは困難である旧セルラーネットワーク構造。フィラメントトレーサー（アンドール）ただし、このモジュールはそのような樹状突起、軸索と棘（構造木のような）で構成されている神経細胞のように定義された構造を測定するために開発されたフィラメント状の3D神経を自動的に検出します。このモジュールは、巧妙に非神経細胞3への形態学的測定を行うために利用されているが、出力データではなくアモルファス状の細胞モデルというより定義されたセルの形状に依存するソフトウェアを使用して拡張セルラーネットワークの情報を提供します。アモルファス状の細胞を分析し、生物学的なアプリケーションへのソフトウェアは、より適切な意思の問題を克服するために、ImarisはImaris Cellを開発しました。これは、細胞内小器官との間の関係を計算するために開発されたEidgenössische工科音楽大学との科学的なプロジェクトだった。ソフトウェアは、セルごとに1つの原子核を強制することにより、生物学的な制約の検出を可能にしますが、およびセグメント細胞に細胞膜を使用して、それが理想的には空隙なしで細胞表面を作成するため、連続していない蛍光データを分析するために利用することはできません。我々の知る限り、現時点では3Dの蛍光画像から地形情報を提供するには、ユーザーによる変更が可能な自動化されたアプローチは、未定義の形状（ 図1）の細胞空間情報を達成することが開発されていない。
我々は、MATLAB（マットワークス株式会社）にインターフェースImarisコアソフトウェアモジュールとImaris XTを使用して分析プラットフォームを開発しました。これらのツールは、事前定義された形状とすることなく、一貫性のない蛍光ネットワークコンポーネントを持つ細胞の三次元計測を可能にします。さらに、この方法は、コンピュータのアプリケーションに精通している生物学的システムの専門知識を拡張しますが、していない研究者は、細胞動態の形態学的変化の定量を行うことができます。
Protocol
Discussion
我々は、CRFの治療は、その形態やCRF-R2の位置に大きな変化を誘導することを示した。 CRF-R2の変化は選択的アンタゴニスト処理により抑制された。我々は、受容体の変更が検出されなかった、標準的な2Dマルチスペクトル技術を用いて測定することができないことを示した。複雑な3D映像を勉強する能力が形態学的分析のための生物学的パラメーターの複雑さを取り入れることが重要です。我?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々はImaris、Imaris XTとMatlabの使用のためにカリフォルニアの生体イメージング技術開発センター（BIDC）大学サンフランシスコ校に感謝します。我々は、原稿の編集への貢献のためにLK Floren、L. Daitch、技術支援のために、ヘンリーVでKharaziaに感謝します。 1R21DA029966-01と薬局のSEBは、UCSFの学校にMLSMRコレクションをスクリーニングするためのNIHのファストトラック賞（：この作品は、SEB、国立衛生研究所（NIH）にUCSFを通じてアルコール＆薬物乱用のカリフォルニア医学研究の国家からの資金によって支えられディーンのOfficeと臨床薬学）とCLHKに医学部（臨床薬理·実験治療）。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
Referências
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262 (2009).
- Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
- Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
- Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
- Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
- Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
- Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).
