Et analytisk verktøy som kvantifiserer Cellular Morfologi Endringer fra Tredimensjonal fluorescens bilder
Summary
Vi utviklet en programvare-plattform som utnytter Imaris Neuroscience, ImarisXT og MATLAB for å måle endringer i morfologi av en udefinert form hentet fra tre-dimensjonale confocal fluorescens av enkeltceller. Denne romanen tilnærmingen kan brukes til å kvantifisere endringer i cellen form etter reseptor aktivering og representerer derfor en mulig ekstra verktøy for medisiner.
Abstract
De vanligste programvare analyseverktøy tilgjengelig for måling fluorescens bilder er for to-dimensjonale (2D) data som er avhengige av manuelle innstillinger for inkludering og ekskludering av datapunkter, og dataassistert mønstergjenkjenning for å støtte tolkningen og funn av analysen. Det har blitt mer og mer viktig å kunne måle fluorescens bilder konstruert fra tre-dimensjonale (3D) datasett for å kunne fange kompleksiteten av cellulære dynamikk og forstå grunnlaget av cellulær plastisitet innen biologiske systemer. Sofistikert mikroskopi instrumenter har tillatt visualisering av 3D fluorescens bilder gjennom oppkjøpet av multispektrale fluorescens bilder og kraftig analytisk programvare som rekonstruerer bildene fra confocal stabler som deretter gir en 3D-representasjon av de innsamlede 2D-bilder. Avanserte design-baserte stereology metoder har gått fra tilnærmelse og forutsetninger for original modellbasert stereology pt selv i komplekse vev seksjoner 2. Til tross for disse fremskritt i vitenskapelige mikroskopi, forblir et behov for en automatisert analytisk metode som fullt utnytter den iboende 3D data for å tillate analyse og kvantifisering av de komplekse forandringer i cellemorfologi, protein lokalisering og reseptor menneskehandel.
Dagens teknikker tilgjengelig for å kvantifisere fluorescens bilder inkluderer Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) og Image J (NIH) som gir manuell analyse. Imaris (Andor Technology, Belfast, Nord-Irland) programvare gir funksjonen MeasurementPro, som gjør at manuell oppretting av målepunkter som kan plasseres i et volum bilde eller trukket på en rekke 2D skiver for å lage et 3D-objekt. Denne metoden er nyttig for enkelt-klikk punktmålinger å måle en linje avstand mellom to objekter, eller for å opprette et polygon som omslutter et område av interesse, men det er vanskelig å anvende på komplex mobilnettverk strukturer. Filament Tracer (Andor) tillater automatisk deteksjon av 3D neuronale filament-lignende har imidlertid dette modul blitt utviklet for å måle definerte strukturer som nevroner, som er omfattet av dendritter, axoner og spines (tre-lignende struktur). Denne modulen er sinnrikt utnyttes til å lage morfologiske målinger til ikke-neuronale celler 3 imidlertid utdata gir informasjon av et utvidet mobilnettet ved hjelp av en programvare som er avhengig av et definert cellen form snarere enn å være en amorf-formet cellulær modell. For å overvinne problemet med å analysere amorft-formede celler og gjør programvaren mer egnet til en biologisk anvendelse, utviklet Imaris Imaris Cell. Dette var en vitenskapelig prosjekt med Eidgenössische Technische Hochschule, som har blitt utviklet for å beregne forholdet mellom celler og organeller. Mens programvaren muliggjør påvisning av biologiske begrensninger, ved å tvinge en kjerne per celleog ved hjelp av celle membraner å segmentere celler, kan det ikke bli benyttet for å analysere fluorescens data som ikke kontinuerlig fordi ideelt den bygger celleoverflaten uten tomrom. Til vår kunnskap, i dag ingen bruker-modifiserbare automatisert tilnærming som gir morfometrisk informasjon fra 3D fluorescens bilder har blitt utviklet som oppnår mobilnettet romlig informasjon om en udefinert form (figur 1).
Vi har utviklet en analytisk plattform med Imaris kjerne programvaremodulen og Imaris XT tilkobles MATLAB (Mat Works, Inc.). Disse verktøyene lar 3D måling av celler uten en forhåndsdefinert form og med inkonsekvente fluorescens nettverkskomponenter. Videre vil denne metoden gi forskerne som har utvidet kompetanse i biologiske systemer, men ikke kjennskap til dataprogrammer, for å utføre kvantifisering av morfologiske endringer i celle dynamikk.
Protocol
Discussion
Vi viste at CRF behandling induserte en betydelig endring i morfologi og plassering av CRF-R2. Endringen i CRF-R2 ble hemmet ved selektiv antagonist. Vi viste at reseptor modifikasjoner som ikke ble oppdaget og kan ikke måles med standard 2D multispektrale teknikker. Evnen til å studere komplekse 3D bilder er kritisk å innlemme kompleksiteten av biologiske parametre for morfometrisk analyse. Vi var i stand til å lage 3D-målinger av celler uten en forhåndsdefinert form med inkonsekvent fluorescens nettverkskomponen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Biologisk Imaging Development Center (BIDC) University of California, San Francisco for bruk av Imaris, Imaris XT og Matlab. Vi takker V. Kharazia for teknisk assistanse og AT Henry, LK Floren, L. Daitch for deres bidrag til redigeringen av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av midler fra staten California Medical Research on Alcohol & Substance Abuse gjennom UCSF til SEB, National Institutes of Health: 1R21DA029966-01 og NIH Fast Track award å skjerme MLSMR samlingen til SEB, UCSF School of Pharmacy ( Dean kontor og klinisk farmasi) og School of Medicine (Clinical Pharmacology & Experimental Therapeutics) til CLHK.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
Referências
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262 (2009).
- Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
- Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
- Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
- Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
- Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
- Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).
