Uma ferramenta analítica que quantifica Alterações morfologia celular de imagens tridimensionais de fluorescência
Summary
Nós desenvolvemos uma plataforma de software que utiliza Imaris Neuroscience, ImarisXT e MATLAB para medir as alterações na morfologia de uma forma indefinida retirado tridimensional fluorescência confocal de células individuais. Esta nova abordagem pode ser utilizada para quantificar as alterações na forma da célula após a activação do receptor e, portanto, representa um instrumento adicional possível para a descoberta de drogas.
Abstract
As ferramentas de software mais comuns de análise disponíveis para a medição de imagens de fluorescência são para dados bidimensionais (2D) que dependem de ajustes manuais para inclusão e exclusão de pontos de dados, e auxiliado por computador de reconhecimento de padrão para apoiar a interpretação e as conclusões da análise. Tornou-se cada vez mais importante ser capaz de medir imagens de fluorescência construídos a partir de conjuntos de dados tridimensionais (3D) a fim de ser capaz de captar a complexidade da dinâmica celular e compreender a base de plasticidade celular dentro de sistemas biológicos. Instrumentos sofisticados de microscopia permitiram a visualização de imagens 3D de fluorescência através da aquisição de imagens de fluorescência multiespectrais e software analítico poderoso que reconstrói as imagens a partir de pilhas confocal que, então, fornecem uma representação em 3D das imagens recolhidas 2D. Avançados métodos de projeto baseados em estereologia evoluíram a partir da aproximação e suposições da original estereologia modelo baseado em um mesmo em cortes de tecidos complexos 2. Apesar destes avanços científicos em microscopia, permanece a necessidade de um método automatizado analítico que explora plenamente os dados intrínsecos 3D para permitir a análise e quantificação das mudanças complexas na morfologia celular, localização de proteínas e tráfico receptor.
Técnicas correntes disponíveis para quantificar as imagens de fluorescência incluem meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) e Image J (NIH), que fornecem uma análise manual. Imaris software (Andor Technology, Belfast, Irlanda do Norte) fornece o recurso MeasurementPro, que permite a criação manual de pontos de medição que podem ser colocados em uma imagem de volume ou desenhados em uma série de fatias de 2D para criar um objeto 3D. Este método é útil para a medição de um único clique de ponto para medir a distância da linha entre dois objectos, ou para criar um polígono que inclui uma região de interesse, mas é difícil de aplicar a complex celulares estruturas de rede. Filamento Tracer (Andor) permite a detecção automática do neuronal 3D filamento como no entanto, este módulo foi desenvolvido para medir estruturas definidas, como neurônios, que são compostas de dendritos, axônios e espinhas (árvore-como estrutura). Este módulo foi engenhosamente utilizado para fazer medições morfológicas células não neuronais 3, no entanto, os dados de saída de informação de uma extensa rede celular por meio de um software que depende de uma forma da célula em vez de ser definido um modelo em forma amorfa celular. Para superar o problema da análise amorfo em forma de células e fazendo com que o software mais adequado para uma aplicação biológica, Imaris desenvolvido celular Imaris. Este foi um projeto científico com Eidgenössische Technische Hochschule, que tem sido desenvolvido para o cálculo da relação entre as células e organelas. Enquanto o software permite a detecção de restrições biológicas, forçando um núcleo por célulae usando membranas de células para as células do segmento, ele não pode ser utilizado para analisar os dados de fluorescência que não são idealmente contínuo porque ele cria na superfície celular, sem espaços vazios. Para nosso conhecimento, no momento nenhuma abordagem modificável pelo usuário automatizado que fornece informações morfométrica de 3D imagens de fluorescência foi desenvolvido que atinge informação espacial celular de uma forma indefinida (Figura 1).
Nós desenvolvemos uma plataforma analítica usando o módulo de software Imaris núcleo e Imaris XT interface com MATLAB (Mat Works, Inc.). Estas ferramentas permitem a medição 3D de células sem uma forma pré-definida e com os componentes da rede de fluorescência inconsistentes. Além disso, este método vai permitir aos pesquisadores que estenderam experiência em sistemas biológicos, mas não familiaridade com aplicativos de computador, para realizar a quantificação de alterações morfológicas na dinâmica celulares.
Protocol
Discussion
Nós mostramos que o tratamento CRF induz uma alteração significativa na morfologia e localização do CRF-R2. A mudança de CRF-R2 foi inibida pelo tratamento com o antagonista selectivo. Nós demonstramos que as modificações do receptor não foi detectada e não pode ser medida usando as técnicas padrão de 2D multiespectrais. A capacidade para estudar as imagens 3D complexas é essencial para incorporar a complexidade de parâmetros biológicos para análise morfométrica. Fomos capazes de fazer medições em 3D…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Centro de Desenvolvimento de Imagens Biológicas (BIDC) da Universidade da Califórnia, San Francisco para o uso do Imaris, XT Imaris e Matlab. Agradecemos a V. Kharazia para a assistência técnica e para Henry, LK Floren, L. Daitch por suas contribuições para a edição do manuscrito. Este trabalho foi financiado por fundos do Estado da Califórnia Medical Research em Álcool e Abuso de Substâncias através UCSF a SEB, dos Institutos Nacionais de Saúde: 1R21DA029966-01 e NIH prêmio Fast Track para a tela a coleção MLSMR a SEB, UCSF Faculdade de Farmácia ( Escritório de Dean e Farmácia Clínica) e da Faculdade de Medicina (Farmacologia Clínica e Terapêutica Experimental) para CLHK.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
Referências
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