Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı
Summary
Biz tek hücrelerin üç boyutlu konfokal floresans alınan tanımsız bir şekil morfolojisi değişiklikleri ölçmek için Imaris Nörobilim, ImarisXT ve MATLAB kullanan bir yazılım platformu geliştirdi. Bu yeni yaklaşım, reseptör aktivasyonunu takiben hücre şekli değişiklikleri ölçmek için kullanılır ve bu nedenle ilaç keşfi için olası ek bir araç temsil edilebilir.
Abstract
Floresans görüntüleri ölçüm için mevcut en yaygın yazılım analiz araçları veri noktaları ve analizlerin yorumlanması ve bulgularını desteklemek için bilgisayar destekli desen tanıma dahil etme ve dışlama manuel ayarlar güveniyor (2D) iki boyutlu veriler için vardır. Bu hücresel dinamikleri karmaşıklığına yakalamak ve biyolojik sistemler içinde hücre plastisite temelini anlamak mümkün olabilmesi için (3D) üç boyutlu veri setleri inşa floresans görüntüleri ölçebilmek için giderek daha önemli hale gelmiştir. Sofistike mikroskopi aletleri multispektral floresans görüntüler ve ardından toplanan 2D görüntüleri 3D temsilini sağlamak konfokal yığınlardan alınan görüntülerin yeniden yapılandırır güçlü analitik yazılım satın alma yoluyla 3D floresans görüntüler görselleştirme izin var. Gelişmiş tasarım tabanlı stereoloji yöntemleri Origina yaklaştırılması ve varsayımlardan ilerlemiştirhatta karmaşık doku kesitlerinde 2 l model tabanlı stereoloji 1. Mikroskopi bu bilimsel gelişmelere rağmen, ihtiyacı tam hücre morfolojisi, protein lokalizasyonu ve reseptör ticareti karmaşık değişimlerin analizi ve ölçümü için izin vermek için içsel 3D veri kullanan bir otomatik analitik yöntem için kalır.
Floresans görüntüleri ölçmek için kullanılabilir Mevcut teknikler Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ve manuel analiz sağlamak Image J (NIH) içerir. Imaris (Andor Teknoloji, Belfast, Kuzey İrlanda) yazılımı bir ses dosyasını yerleştirilir ya da bir 3D nesne oluşturmak için 2D dilim bir dizi üzerine çizilebilir ölçüm noktalarının manuel oluşturulması sağlayan özelliği MeasurementPro sağlar. Bu yöntem, iki nesne arasında bir çizgi mesafe ölçmek ya da ilgilenilen bölge kapsayan bir çokgen oluşturmak için tek tıklama nokta ölçümleri için yararlıdır, ama compl uygulamak zordurex hücresel ağ yapıları. Filament Tracer (Andor) Ancak, bu modül gibi dendritler, akson ve dikenler (yapı ağacı gibi) oluşmaktadır nöronlar olarak tanımlanan yapıları ölçmek için geliştirilmiştir filament benzeri 3D nöronal otomatik algılama sağlar. Bu modül, ustaca nöronal olmayan hücreler 3 morfolojik ölçümler yapmak için kullanılmıştır, ancak çıkış verileri yerine bir amorf-şekilli hücre modeli olan daha tanımlanmış hücre şekline bağlıdır bir yazılım kullanılarak genişletilmiş bir hücresel ağ üzerinden bilgi sağlar. Amorf şekilli hücrelerin analiz ve biyolojik bir uygulama yazılımı daha uygun yapma sorunu aşmak için, Imaris Imaris Hücre geliştirdi. Bu hücre ve organeller arasındaki ilişkiyi hesaplamak için geliştirilmiştir Eidgenössische Technische Hochschule, bilimsel bir proje oldu. Yazılım hücre başına bir çekirdeği zorlayarak, biyolojik sınırların tespiti sağlarkenve segment hücrelere hücre zarlarını kullanarak, ideal geçersiz boşluksuz hücre yüzey oluşturur, çünkü sürekli değildir floresans verileri analiz etmek için kullanılan olamaz. Bildiğimiz kadarıyla, şu anda 3D floresans görüntüleri morfometrik bilgi sağlayan hiçbir kullanıcı tarafından değiştirilebilir otomatik yaklaşım tanımlanmamış bir şekli (Şekil 1) hücresel mekansal bilgi ulaştığından emin geliştirilmiştir.
Biz MATLAB (Mat İşleri, Inc) da koordine Imaris çekirdek yazılım modülü ve Imaris XT kullanarak bir analitik platformu geliştirdi. Bu araçlar önceden tanımlanmış bir şekil vermeden ve tutarsız floresans ağ bileşenleri ile hücrelerin 3D ölçüm sağlar. Ayrıca, bu yöntem hücre dinamikleri morfolojik değişikliklerin ölçümü gerçekleştirmek için, bilgisayar uygulamalarına aşinalık biyolojik sistemlerde uzmanlık genişletilmiş, ancak araştırmacılar sağlayacaktır.
Protocol
Discussion
Biz CRF tedavisi önemli bir morfolojik değişim ve KBY-R2 yer indüklenen göstermiştir. CRF-R2 değişiklik seçici antagonisti tedavisi ile inhibe edilmiştir. Biz reseptör değişiklikleri standart 2D multispektral teknikler kullanılarak tespit edilmemiştir ve ölçülemez olduğunu gösterdi. Karmaşık 3D görüntüler çalışmaya yeteneği morfometrik analiz için biyolojik parametrelerin karmaşıklığı dahil etmek önemlidir. Biz tutarsız floresans ağ bileşenleri ile önceden tanımlanmış bir şeki…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Imaris, Imaris XT ve Matlab kullanımı için Kaliforniya Biyolojik Görüntüleme Geliştirme Merkezi (BIDC) Üniversitesi, San Francisco ederim. Biz teknik yardım ve Henry, LK Floren, yazının düzenleme katkılarından dolayı L. Daitch AT V. Kharazia ederim. 1R21DA029966-01 ve Eczacılık SEB, UCSF Okulu MLSMR koleksiyonu ekrana NIH Fast Track ödülü (: Bu çalışma SEB, Ulusal Sağlık Enstitüleri UCSF aracılığıyla Alkol ve Madde Bağımlılığı ile ilgili Kaliforniya Tıbbi Araştırma Devlet fon tarafından desteklenmiştir Dekanlık ve Klinik Eczacılık) ve CLHK Tıp Fakültesi (Klinik Farmakoloji ve Deneysel Therapeutics).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
Referências
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262 (2009).
- Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
- Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
- Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
- Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
- Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
- Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).
