Et analyseværktøj, der kvantificerer cellemorfologi Ændringer fra Tredimensionelle fluorescensbilleder
Summary
Vi udviklede en software platform, der anvender Imaris Neuroscience, ImarisXT og MATLAB til at måle ændringerne i morfologi af en udefineret form, taget fra tredimensionel konfokal fluorescens af enkeltceller. Denne hidtil ukendte fremgangsmåde kan anvendes til at kvantificere ændringer i celleform efter receptoraktivering og derfor repræsenterer en mulig yderligere værktøj til opdagelse af lægemidler.
Abstract
De mest almindelige software analyseværktøjer til rådighed til måling af fluorescens billeder er for to-dimensionelle (2D) data, der er afhængige af manuelle indstillinger for inklusion og eksklusion af datapunkter, og computerstøttet mønstergenkendelse til at understøtte fortolkningen og resultater af analysen. Det er blevet stadig vigtigere at kunne måle fluorescensbilleder opbygget af tredimensionale (3D) datasæt, for at kunne opfange de komplekse cellulære dynamik og forstå grundlaget for cellulære plasticitet i biologiske systemer. Sofistikerede mikroskopi instrumenter har gjort det muligt at visualisering af 3D fluorescensbilleder gennem erhvervelsen af multispektrale fluorescens billeder og kraftfuld analytisk software, der rekonstruerer billederne fra konfokale stakke, der så giver en 3D-repræsentation af de indsamlede 2D-billeder. Avancerede design-baserede stereologi metoder har udviklet sig fra den tilnærmelse og antagelser af original modelbaseret stereologi 1 selv i komplekse vævssektioner 2. På trods af disse videnskabelige fremskridt inden for mikroskopi, er fortsat et behov for en automatiseret analytisk metode, der fuldt ud udnytter de iboende 3D-data for at muliggøre analyse og kvantificering af de komplekse ændringer i cellemorfologi, protein lokalisering og receptor menneskehandel.
Nuværende teknikker til rådighed til at kvantificere fluorescensbilleder inkluderer Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), og Image J (NIH), som giver manuel analyse. Imaris (Andor Technology, Belfast, Nordirland) software giver funktionen MeasurementPro, som giver den manuelle skabelse af målepunkter, der kan placeres i et volumen billede eller trukket på en række 2D skiver til at skabe et 3D-objekt. Denne metode er nyttig for enkelt-klik punktmålinger at måle en linie afstand mellem to objekter eller at oprette en polygon, som omslutter et område af interesse, men det er vanskeligt at anvende på complex mobilnetværk strukturer. Filament Tracer (Andor) muliggør automatisk registrering af 3D neuronal filamentlignende dog har dette modul er udviklet til måling af definerede strukturer, såsom neuroner, som består af dendritter, axoner og rygsøjle (trælignende struktur). Dette modul er sindrigt anvendt til at udføre morfologiske målinger til ikke-neuronale celler 3, dog udlæsningsdataene giver oplysninger om en udvidet mobilnetværk ved hjælp af en software, der afhænger af en defineret celleform snarere end en amorf-formet cellulær model. For at overvinde problemet med at analysere amorfe-formede celler og gør softwaren mere egnet til en biologisk applikation, Imaris udviklet Imaris Cell. Dette var et videnskabeligt projekt med Eidgenoessische Technische Hochschule, der er udviklet til at beregne forholdet mellem celler og organeller. Mens software muliggør påvisning af biologiske begrænsninger, ved at tvinge en kerne per celleog anvendelse af cellemembraner at segmentere celler, kan det ikke anvendes til at analysere fluorescensdata, der ikke er kontinuerlig eftersom ideelt set det bygger celleoverfladen uden hulrum. Til vores viden, ingen bruger-modificerbare automatiseret metode, der giver morfometrisk oplysninger fra 3D fluorescensbilleder på nuværende tidspunkt er blevet udviklet, som opnår cellulær geografisk information af en udefineret form (figur 1).
Vi har udviklet en analytisk platform ved hjælp af Imaris kernesoftware modul og Imaris XT grænseflader til MATLAB (Mat Works, Inc.). Disse værktøjer giver 3D måling af celler uden en forud fastsat form og med inkonsekvente fluorescens netværkskomponenter. Endvidere vil denne metode give forskere, der har udvidet ekspertise i biologiske systemer, men ikke kendskab til edb-applikationer, til at udføre kvantificering af morfologiske ændringer i celle dynamik.
Protocol
Discussion
Vi viste, at CRF behandling inducerede en signifikant ændring i morfologi og placering af CRF-R2. Ændringen i CRF-R2 blev inhiberet ved selektiv antagonist behandling. Vi viste, at receptor ændringer ikke blev opdaget og ikke kan måles ved hjælp af de almindelige 2D multispektrale teknikker. Evnen til at undersøge komplekse 3D-billeder er kritisk at inkorporere de komplekse biologiske parametre for morfometrisk analyse. Vi var i stand til at gøre 3D målinger af celler uden en foruddefineret form med uoverensstem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Biologisk Imaging Development Center (BIDC) University of California, San Francisco for brugen af Imaris, Imaris XT og Matlab. Vi takker V. Kharazia til teknisk assistance og AT Henry, LK Floren, L. Daitch for deres bidrag til redigering af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af midler fra staten Californien Medical Research on Alcohol & Substance Abuse gennem UCSF til SEB, National Institutes of Health: 1R21DA029966-01 og NIH Fast Track pris at screene MLSMR indsamling til SEB, UCSF School of Pharmacy ( dekanatet og Klinisk Farmaci) og School of Medicine (Clinical Pharmacology & Experimental Therapeutics) til CLHK.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
References
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262 (2009).
- Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
- Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
- Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
- Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
- Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
- Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).
