Kompakte kvanteprikker for Single-molekylet Imaging

Summary

Vi beskriver fremstillingen av kolloidale kvanteprikker med minimert hydrodynamisk størrelse for single-molekyl fluorescens imaging. Sammenlignet med konvensjonelle kvanteprikker, disse nanopartiklene er omtrent samme størrelse som globular proteiner og er optimalisert for single-molekyl lysstyrke, stabilitet mot fotonedbrytning, og motstand mot uspesifikke binding til proteiner og celler.

Abstract

Enkelt-molekyl imaging er et viktig verktøy for å forstå mekanismene for biomolekylære funksjon og for å visualisere romlige og tidsmessige heterogenitet av molekylære atferd som ligger til grunn cellebiologi ^1-4. Å image en enkelt molekyl av interesse, er det vanligvis konjugert til en fluoriserende tag (fargestoff, protein, perle, eller quantum prikk) og observert med epifluorescence eller total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi. Mens fargestoffer og fluorescerende proteiner har vært bærebjelken i fluorescens bildebehandling i flere tiår, er deres fluorescens ustabil under høye foton flukser er nødvendige for å observere individuelle molekyler, gir bare noen få sekunder av observasjon før fullstendig tap av signal. Lateksperler og dye-merkede perler gir forbedret signal stabilitet, men på bekostning av drastisk større hydrodynamisk størrelse, som kan skadelig endre diffusjon og oppførselen til molekylet under studien.

ntent "> Quantum prikker (QDs) tilbyr en balanse mellom disse to problematiske regimer. Disse nanopartikler består av halvledermaterialer, og kan være konstruert med en hydrodynamisk kompakt størrelse med eksepsjonell motstand mot fotonedbrytning ^5. Dermed siste årene QDs har vært medvirkende i slik langsiktig observasjon av komplekse macromolecular oppførsel på ett molekyl-nivå. Men disse partiklene har likevel blitt funnet å utvise nedsatt diffusjon i overfylte molekylære miljøer som mobilnettet cytoplasma og nevrale synaptiske spalten, der deres størrelser er fortsatt for stor ^{4,6 , 7.}

Nylig har vi utviklet kjernene og overflatebelegg av QDs for minimal hydrodynamisk størrelse, mens balansere forskyvninger til kolloidal stabilitet, fotostabilitet, lysstyrke og uspesifikke binding som har hindret nytten av kompakte QDs i det siste ^8,9. Målet med denne artikkelen er å visesyntesen, modifikasjon og karakterisering av disse optimaliserte nanokrystaller, sammensatt av et legert Hg _x CD _1-x Se kjerne belagt med et isolerende Cd _y Zn _1-y S skall, videre belagt med en polymer multidentate ligand modifisert med korte polyetylenglykol ( PEG) kjeder (figur 1). Sammenlignet med konvensjonelle CdSe nanokrystaller, Hg _{x CD 1-x} Sé legeringer tilby større quantum utbytter av fluorescens, fluorescens på rødt og nær-infrarøde bølgelengder for forbedret signal-til-støy i celler, og eksitasjon på ikke-cytotoksiske synlige bølgelengder. Multidentate polymer belegg binder seg til nanocrystal overflaten i en lukket og flat konformasjon å minimere hydrodynamisk størrelse, og PEG nøytraliserer overflateladning for å minimere ikke-spesifikke binding til celler og biomolekyler. Sluttresultatet er en lyst fluorescerende nanocrystal med utslipp mellom 550-800 nm og en total hydrodynamisk størrelse nær 12 nm. Dette er i same størrelsesområdet så mange løselig globular proteiner i celler, og betydelig mindre enn konvensjonelle pegylert QDs (25-35 nm).

Protocol

Følgende syntese prosedyrer involverer standard luft-frie teknikker og bruk av et vakuum / inert gass manifold; detaljerte metoder kan finnes i referanser 10 og 11.. HMS for alle potensielt giftige og brannfarlige stoffer bør konsulteres før bruk og all brannfarlige og / eller air-labile forbindelser skal alikvoteres inn septum-forseglede ampuller i en hanskerommet eller hanske bag. 1. Syntese av Mercury kadmium selen (Hg x Cd 1-x Se) Quantum Dot kjerner F…

Representative Results

Figur 2 viser representative absorpsjon og fluorescensspektra for CdSe nanokrystaller, Hg x CD 1-x SE nanokrystaller etter kationebytter, og Hg x Cd 1-x Se / Cd y Zn 1-y S nanokrystaller etter skall vekst. Kjernen CdSe nanokrystaller har en kvanteutbytte av fluorescens nær 15% (inkludert lang bølgelengde dype felle utslipp), men denne effektiviteten synker til mindre enn 1% etter kvikksølv utveksling, sannsynligvis på grunn av ladningsbærere fe…

Discussion

Sammenlignet med konvensjonelle CdSe kvanteprikker, kan trefoldig legering Hg _{x CD 1-x} SE nanokrystaller være innstilt på størrelse og fluorescens bølgelengde uavhengig. Størrelsen er første valgt under syntesen av CdSe nanocrystal kjerner, og fluorescensen bølgelengden er valgt på en sekundær kvikksølv kationebytter steg, som ikke i vesentlig grad endre nanocrystal størrelse ^9. Det er viktig å tillate det rensede Hg _x CD _1-x Sé nanokrystaller inkubere ved romtemp…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Selenium	Sigma-Aldrich	229865
Tri-n-octylphosphine	Strem	15-6655	97% pure, unstable in air
Cadmium oxide	Sigma-Aldrich	202894	Highly toxic: use caution
Tetradecylphosphonic acid	PCI Synthesis	4671-75-4
Octadecene	Alfa Aesar	L11004	Technical grade
Hexadecylamine	Sigma-Aldrich	H7408
Diphenylphosphine	Sigma-Aldrich	252964	Pyrophoric
Mercury acetate	Sigma-Aldrich	456012	Highly toxic: use caution
1-Octanethiol	Sigma-Aldrich	471836	Strong odor
Oleic acid	Sigma-Aldrich	W281506
Zinc acetate	Alfa Aesar	35792
Cadmium acetate hydrate	Sigma-Aldrich	229490	Highly toxic: use caution
Oleylamine	Fisher Scientific	AC12954	Unstable in air
Sulfur	Sigma-Aldrich	344621
Trioctylphosphine oxide	Strem	15-6661	99%
Pyridine	VWR	EM-PX2012-6	Anhydrous
Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M1753	Strong odor
Triethylamine	Sigma-Aldrich	471283	Anhydrous
Dialysis tubing	Spectrum Labs	131342	20 kDa cutoff
Centrifugal filter	Millipore	UFC801024	10 kDa cutoff
Monoamino-PEG	Rapp Polymere	12 750-2	750 Da
DMTMM, 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride hydrate	Alfa Aesar	H26333
AKTAprime Plus Chromatography System	GE HealthCare
Superose 6 10/300 GL chromatography column	GE HealthCare	17-5172-01
Agarose, OmniPur	VWR	EM-2120
			Appendix Synthesis of mercury octanethiolate: Slowly add a methanol solution of mercury acetate (1 eq.) to a stirring solution of 1-octanethiol (3 eq.) and potassium hydroxide (3 eq.) in methanol at room temperature. Isolate the mercury(II) octanethiolate precipitate via filtration, wash two times with methanol and once with ether, and then dry under vacuum. Synthesis of multidentate polymer: Dissolve polyacrylic acid (1 g, 1,773 Da) in 25 ml dimethylformamide (DMF) in a 150 ml three-necked flask and bubble with argon for 30 min. Add an anhydrous solution of cysteamine (374 mg, 4.87 mmol) in 10 ml DMF. At room temperature with vigorous stirring, slowly add anhydrous diisopropylcarbodiimide (DIC, 736 mg, 5.83 mmol) over 30 min, followed by triethylamine (170 μl, 1.22 mmol), and allow the reaction to proceed for 72 hr at 60 °C. Add mercaptoethanol (501 mg, 6.41 mmol) to quench the reaction, and stir for 2 hr at room temperature. Remove DMF via rotary evaporation and isolate the polymer with the addition of a 2:1 mixture of ice-cold acetone:chloroform, followed by centrifugation. Dissolve the polymer in ~5 ml anhydrous DMF, filter, precipitate again with diethyl ether, and repeat. Dry the product under vacuum and store under argon. Determination of CdSe core diameter: From the UV-Vis absorption spectrum determine the wavelength of the first exciton peak (λ, in nm), which is the longest-wavelength peak (e.g. roughly 498 nm for CdSe in Figure 2a), and use the sizing curve of Mulvaney and coworkers 12: Determination of CdSe nanocrystal concentration: From a background-subtracted UV-Vis spectrum of an optically clear solution of CdSe nanocrystals, determine the absorption at 350 nm wavelength. Serial dilutions can be used to determine if the optical absorption is within the linear range of Beer’s Law. The nanocrystal concentration (QD, in M) can be determined by plugging in the nanocrystal diameter (D, in nm), the optical absorption value (A3sa), and the cuvette path length (l, in cm) into the following equation from the empirical correlation of Bawendi and coworkers 13: