Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers mit Microarrays
Summary
Eine Technik namens<strong> C</strong> Mfassende<strong> M</strong> Icroarray<strong> P</strong> Olymer Profiling (Kompp) zur Charakterisierung von Pflanzenzellwand Glycane beschrieben. Dieses Verfahren kombiniert die Spezifität von monoklonalen Antikörpern, die auf definierte Glycan-Epitope mit einer Miniatur-Mikroarray analytische Plattform ermöglicht Screening Glycan Auftretens in einem breiten Bereich von biologischen Zusammenhänge.
Abstract
Pflanzliche Zellwände sind komplexe Matrizen von heterogenen Glykane, die eine wichtige Rolle in der Physiologie und Entwicklung von Pflanzen spielen und die Rohstoffe für menschliche Gesellschaften (zB Holz, Papier, Textil-und Biokraftstoff-Industrie) 1,2. Das Verständnis der Biosynthese und Funktion dieser Komponenten bleibt eine Herausforderung.
Zellwand Glycane sind chemisch und konformativ vielfältigen aufgrund der Komplexität ihrer Bausteine, die Glycosylreste. Diese Form Bindungen an mehreren Positionen unterscheiden sich in Ringstruktur, isomerer oder anomeren Konfiguration, und darüber hinaus werden mit einer Anordnung von nicht-substituierten Zuckerreste. Glycan Zusammensetzung variiert in verschiedenen Zell-und / oder Gewebetypen oder sogar Sub-Domänen eines einzelnen Zellwand 3. Außerdem ist deren Zusammensetzung auch während der Entwicklung ein, oder in Reaktion auf Umweltreize 4 modifiziert.
In exProzess von 2.000 Gene Pflanzliche Zellwände sind komplexe Matrizen von heterogenen Glykane wird vorausgesagt, dass in der Zellwand Glykan Biosynthese und Modifikation in Arabidopsis 5 einbezogen werden. Jedoch haben relativ wenige der biosynthetischen Gene funktionell charakterisiert 4,5. Reversen Genetik Ansätze sind schwierig, da die Gene oft differentiell exprimiert werden, oft in geringen Konzentrationen, zwischen Zelltypen 6. Außerdem sind mutierte Studien oft durch Gen-Redundanz oder kompensatorische Mechanismen behindert zur Gewährleistung einer angemessenen Zellwand Funktion 7 wird beibehalten. So neuartige Ansätze sind nötig, um schnell prägen die vielfältige Palette von Glykanstrukturen und funktionelle Genomik Ansätze zum Verständnis der Zellwandbiosynthese und Modifikation zu erleichtern.
Monoklonale Antikörper (mAbs) 8,9 haben als ein wichtiges Instrument zur Bestimmung Glykan Struktur und Verteilung in Pflanzen entstanden. Diese erkennen distINCT Epitope in die Hauptklassen der pflanzlichen Zellwand Glykane, darunter Pektine, Xyloglucanen, Xylane, Mannane, Glucane und Arabinogalactane. Kürzlich ist ihre Verwendung im großen Maßstab Screening-Experimenten wurde erweitert, um die relative Häufigkeit von Glykanen in einer breiten Palette von Pflanzen-und Gewebetypen gleichzeitig 9,10,11 bestimmen.
Hier präsentieren wir eine Microarray-basierte Glykan Screening-Methode aufgerufen Umfassende Microarray Polymer Profiling (Kompp) (Abbildungen 1 und 2) 10,11, die mehrere Proben ermöglicht (100 Sek.) gescreent unter Verwendung einer miniaturisierten Microarray-Plattform mit reduzierter Reagenz-und Probenmengen werden. Die Spot-Signale auf dem Mikroarray kann formal quantifiziert werden, um semi-quantitative Daten über Glykan Epitop Auftreten zu geben. Dieser Ansatz wird auch zur Verfolgung Glykan Veränderungen in komplexen biologischen Systemen 12 und bietet einen umfassenden Überblick der Zellwand Zusammensetzung geeignet vor allem, wenn Vorkenntnisse of ist nicht verfügbar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kompp ist eine schnelle und sensitive Methode zur Profilierung der Glycan Zusammensetzung von Hunderten pflanzlichen Proben in einer Angelegenheit von Tagen. Diese Methode ergänzt die bereits vorhandenen bakteriellen oder Säugetier-Glykan Array-Plattformen für das Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-Wechselwirkungen mit Glycan-bindende Proteine wie Lektine, Rezeptoren, Antikörper und 16. Mit einer großen Vielfalt von Sonden zur Erkennung von Zellwand Glykane, ist es möglich, detaillierte Info…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IEM möchte den dänischen Research Council (FTP und FNU) für die Finanzierung zu bestätigen. ERL erkennt die Unterstützung eines ARC DP gewähren. AB erkennt die Unterstützung des ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls Zuschuss.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diaminoethane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water & process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) – Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
Referências
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