Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים
Summary
טכניקה הנקראת<strong> C</strong> Omprehensive<strong> M</strong> Icroarray<strong> P</strong> Profiling olymer (CoMPP) לאפיון של glycans דופן תא הצמח מתואר. שיטה זו משלבת את הספציפיות של נוגדנים חד שבטיים המופנים לאפיטופים glycan מוגדרות עם פלטפורמה אנליטית microarray מיניאטורי המאפשרת הקרנה של מופע glycan במגוון רחב של הקשרים ביולוגיים.
Abstract
קירות תא צמח הם מטריצות מורכבות של glycans הטרוגניות אשר משחק תפקיד חשוב בפיסיולוגיה וההתפתחות של צמחים ולספק את חומרי הגלם לחברות אנושיות (למשל תעשיות עץ, נייר, טקסטיל ודלק ביולוגיים) 1,2. עם זאת, הבנת יוסינתזה והתפקוד של רכיבים אלה נותר מאתגרים.
glycans דופן תא מבחינה כימי וconformationally בשל המורכבות של אובניים הבניין שלהם, את שאריות glycosyl מגוון. קשרים אלה טופס בתפקידים מרובים ושונים במבנה טבעת, תצורת isomeric או anomeric, ובנוסף, הם מחליפים עם מערך של שאריות שאינן סוכר. הרכב glycan משתנה בתא אחר ו / או סוגי רקמות או אפילו תת דומיין של תא בודד חומה 3. יתר על כן, ההרכב שלהם גם לשינוי ב1 פיתוח, או בתגובה לאותות סביבתיים 4.
ב לשעברCess של 2,000 גנים יש קירות תא צמח הם מטריצות מורכבות של glycans הטרוגניות נחזה להיות מעורבים בביוסינתזה תא קיר glycan ושינוי ב5 ארבידופסיס. עם זאת, מעטים יחסית של גני biosynthetic התאפיינו תפקודי 4,5. גישות גנטיקה הפוכות הן קשות כי את הגנים לעתים קרובות לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי, לעתים קרובות ברמות נמוכות, בין סוגי תאים 6. כמו כן, מחקרי מוטציה לעתים קרובות הפריעו יתירות גן או מנגנוני פיצוי על מנת להבטיח תפקוד דופן תא מתאים נשמר 7. לכן יש צורך בגישות חדשות במהירות כדי לאפיין מגוון הרחב של מבני glycan וכדי להקל על גישות גנומיקה תפקודיות לביוסינתזה הבנת תא קיר ושינוי.
נוגדנים חד שבטי (בז) 8,9 צמחו ככלי חשוב לקביעת מבנה והפצת glycan בצמחים. אלה מכירים distאפיטופים נוכחיים בתוך סוגים עיקריים של glycans דופן תא צמח, כולל pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans וarabinogalactans inct. לאחרונה השימוש שלהם הוארך לניסויי הקרנה בקנה מידה גדול כדי לקבוע את השפע היחסי של glycans במגוון רחב של צמחים וסוגי רקמות זמנית 9,10,11.
כאן אנו מציגים שיטת microarray מבוססת glycan הקרנה נקראת Profiling המקיף microarray הפולימר (CoMPP) (איורים 1 ו -2) 10,11 המאפשרת דגימות מרובות (100 שניות) שיוקר באמצעות פלטפורמת microarray מוקטנת עם ריאגנט המופחת וכרכי מדגם. אותות הנקודה על microarray ניתן לכמת באופן רשמי לתת נתוני כמותיות על התרחשות epitope glycan. גישה זו מתאימה גם למעקב אחר שינויים במערכות מורכבות glycan ביולוגיות 12 ומתן סקירה כללית של הרכב דופן תא במיוחד כאשר לפני הידע of זו אינה זמינה.
Protocol
Representative Results
Discussion
CoMPP היא שיטה מהירה ורגישה לאפיון הרכב glycan של מאה דגימות צמחיות בעניין של ימים. שיטה זו משלימה את הפלטפורמות הזמינות כבר חיידקים או יונקי glycan מערך לתפוקה גבוהה הקרנה של אינטראקציות פחמימות עם חלבוני glycan מחייב כגון קטינים, קולטנים, ונוגדנים 16. עם מגוון גדול של בדי?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IEM הייתי רוצה להכיר המועצה למחקר הדנית (FTP ו FNU) למימון. ERL מכיר בתמיכה של ARC DP מענק. א.ב. מכיר בתמיכה של מרכז ARC ההצטיינות במענק קירות תא צמח.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diaminoethane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water & process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) – Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
Referências
- Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
- Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
- Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
- Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
- Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
- Sarria, R., Wagner, T. A., O’Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
- Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
- Willats, W. G. T., Knox, J. P., Rose, J. K. C. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. , 92-110 (2003).
- Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
- Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
- Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
- Moller, I. E., Licht, D. e. F. i. n. e., Harholt, H. H., J, , et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506 (2011).
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , (2012).
- Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
- Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
- McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
- Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
- Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
- Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
- 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
- Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
- Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
- Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
- Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).
