マイクロアレイを用いた植物細胞壁ポリマーの糖鎖プロファイリング
Summary
と呼ばれる手法<strong> C</strong> omprehensive<strong> M</strong> icroarray<strong> P</strong植物細胞壁糖鎖の特性評価のための> olymerプロファイリング（CoMPP）について説明する。この方法は、生物学的な文脈の広い範囲で発生したグリカンのスクリーニングを可能にする小型のマイクロアレイ分析プラットフォームで定義された糖鎖エピトープに対するモノクローナル抗体の特異性を兼ね備えています。
Abstract
植物の細胞壁は、植物の生理と発展に重要な役割を果たしており、人間社会のために原材料を提供異種糖鎖の複雑なマトリックス（ 例えば、木材、紙、繊維、バイオ燃料産業）1,2です。しかし、これらの成分の生合成と機能を理解することは困難なままである。
細胞壁糖鎖は、化学とその構築ブロック、グリコシル残基の複雑さに起因するコンフォメーションが多様である。これらのフォームの複数の位置に結合およびリング構造が異なり、異性体またはアノマー配置されているだけでなく、無糖残基の配列で置換されている。グリカンの組成物は、単一細胞壁3の異なる細胞および/ または組織型あるいはサブドメインに変化する。さらに、それらの組成物はまた、開発1時、または環境手がかり4に対応して変更されます。
EXで2000遺伝子の目的税は、植物の細胞壁は、異種の糖鎖の複雑なマトリックスシロイヌナズナ 5で細胞壁糖鎖の生合成と修飾に関与することが予測された多数持っています。しかし、生合成遺伝子の比較的少ないが、機能的に4,5特徴付けられてきた。遺伝子はしばしば差別的細胞型6の間に、多くの場合、低レベルで発現しているので、逆遺伝学的ア プローチが困難である。また、変異体の研究は、多くの場合、適切な細胞壁機能は7に維持されていることを確認するために、遺伝子の冗長性または代償機構によって妨げられている。したがって、新たなアプローチが急速に糖鎖構造の多様な範囲を特徴づけるために理解と細胞壁の生合成と修飾に機能ゲノミクスアプローチを容易にするために必要とされる。
モノクローナル抗体（mAb）8,9は、植物の糖鎖構造と分布を決定するための重要なツールとして浮上している。これらは、dist認識ペクチン、キシログルカン、キシラン、マンナン、グルカンやアラビノガラクタンを含む植物細胞壁糖鎖の主要なクラス内に存在INCTエピトープ。最近、それらの使用は植物や組織の種類を同時に9,10,11の広い範囲で糖鎖の相対量を決定するために、大規模なスクリーニング実験にも拡張されました。
ここでは、複数のサンプル（100秒）が減少した試薬及びサンプル量で小型化されたマイクロアレイプラットフォームを用いてスクリーニングすることができる包括的なマイクロアレイポリマープロファイリング（CoMPP）（ 図1および2）10,11と呼ばれるマイクロアレイベースグリカンスクリーニング法を提案する。マイクロアレイ上のスポット信号は正式に糖鎖エピトープの発生に関する半定量的データを与えるために定量することができる。このアプローチは、複雑な生物システム12の糖鎖変化を追跡し、細胞壁組成のグローバルな概観を提供することに適している場合は特に事前知識Ofはこれができません。
Protocol
1。組織収集＆準備関心のある各組織には、少なくとも三重に植物組織100 mgの生体重（10 mgの乾燥重量の最小値）を収集します。次の手順では、植物組織からの細胞壁物質の調製を記載している。貯蔵組織の場合には、非指名澱粉を酵素的に前述の13のような細胞壁ポリマーの抽出を続行する前に削除されます。 24チューブアダプタセットと3 mmのタングステンカーバイ?…
Representative Results
ニコチアナダイジョの花から6種類の組織における糖鎖の相対的な存在量（葯フィラメント、花粉、卵巣、花弁、萼片と偏見）がCoMPPを用いて決定した。図3Aは、部分的に（低）メチルエステル化homogalacturonan（HG）、ペクチン多糖類14日に発生したエピトープに対して特異的mAb JIM5でプロービングされた代表的なマイクロアレイを示しています。 JIM5エピトープは、しかし、柱頭?…
Discussion
CoMPPは、数日のうちに何百もの植物由来のサンプルの糖組成をプロファイリングするための迅速かつ高感度な方法である。この方法は、レクチン、受容体、抗体16と糖結合タンパク質と糖の相互作用のハイスループットスクリーニングのためにすでに利用可能な細菌または哺乳動物糖鎖アレイ·プラットフォームを補完します。細胞壁糖鎖を検出するための利用可能なプローブの大き?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IEMは資金調達のためにデンマークの研究評議会（FTPとFNU）を承認したいと思います。 ERLは、ARCのDP助成金の支援を認めている。 ABは、植物の細胞壁の助成金で優秀のARCセンターの支援を認めている。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diaminoethane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water & process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) – Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
Referências
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Citar este artigo
Moller, I. E., Pettolino, F. A., Hart, C., Lampugnani, E. R., Willats, W. G., Bacic, A. Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays. J. Vis. Exp. (70), e4238, doi:10.3791/4238 (2012).