Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일
Summary
라고 기술<strong> C</strong> omprehensive<strong> M</strong> icroarray<strong> P</strong식물> olymer 프로파일 (CoMPP)이 설명되어 있습니다. 이 방법은 생물학적 상황의 넓은 범위에서 glycan 발생의 검사를 허용하는 소형 microarray 분석 플랫폼으로 정의 glycan – epitopes로 이동 단클론 항체의 특이성이 조화를 이루고 있습니다.
Abstract
식물 세포의 벽은 생리학과 식물의 개발에 중요한 역할을하고 인간 사회 (예 : 나무, 종이, 섬유 및 바이오 연료 산업) 1,2의 원료를 제공 이기종 glycans의 복잡한 matrixes 있습니다. 그러나, 이러한 구성 요소의 생합성과 기능을 이해하는 것은 도전 남아있다.
세포 벽 glycans는 화학적 및 빌딩 블록, glycosyl 잔류의 복잡성으로 인해 conformationally 다양합니다. 이러한 형태의 여러 위치에서 연계 및 링 구조에서 차이가이 이성질체 또는 anomeric 구성 할 수 있으며,뿐만 아니라, 비 설탕 잔류의 배열로 대체됩니다. Glycan 구성도 다른 셀 및 / 또는 조직 유형 또는 단일 셀 벽 3의 하위 도메인에 따라 다릅니다. 또한, 자신의 구성은 개발 한 동안, 또는 환경 단서 사에 대한 응답으로 수정됩니다.
예에2000 유전자의 운은 식물 세포 벽 이기종 glycans의 복잡한 matrixes Arabidopsis 5 세포벽 glycan 생합성 및 수정에 참여 할 것으로 예상 했었 있습니다. 그러나, biosynthetic 유전자의 비교적 적은은 기능적으로 4,5 특징되었습니다. 유전자는 종종 differentially 세포 유형 6 시까 종종 낮은 수준에서 표현되기 때문에 역 유전학 방법이 어렵습니다. 또한, 돌연변이 연구는 종종 적절한 세포벽 기능이 7 유지하기 위해 유전자 중복이나 보상 메커니즘에 의해 방해되어 있습니다. 따라서 소설 접근 방식은 빠르게 glycan 구조의 다양한 범위를 특징하고 이해 세포벽 생합성 및 수정에 기능 유전체학 접근을 촉진하기 위하여 필요합니다.
단클론 항체 (mAbs)는 8,9 식물의 glycan 구조와 분포를 결정하는 중요한 도구로 부각되었습니다. 이러한 지구 인식pectins, xyloglucans, xylans, mannans, 글루칸과 arabinogalactans 등의 식물 세포의 벽 glycans의 주요 클래스, 내 현재 inct의 epitopes. 최근의 사용은 공장 및 조직 유형 동시에 9,10,11의 넓은 범위에서 glycans의 상대적 풍부한을 결정하기 위해 대규모 심사 실험으로 확장되었습니다.
여기 감소 시약 및 샘플 볼륨과 소형화 microarray 플랫폼을 사용하여 상영 할 (100 초) 여러 샘플을 수 종합 Microarray 폴리머 프로파일 (CoMPP) (그림 1 & 2) 10,11라는 microarray 기반 glycan 검사 방법을 제시한다. microarray의 현장 신호 공식적으로 glycan 에피토프의 발생에 대한 반 정량 데이터를 제공하기 위해 정량화 할 수 있습니다. 이 방법은 잘 복잡한 생물학적 시스템 12 glycan 변경 사항을 추적하고 세포벽 성분의 글로벌 개요를 제공하는 데 적합합니다 특히 때 사전 지식 OF이 사용할 수 없습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CoMPP는 단 몇일 만에 수백 개의 공장 파생 샘플 glycan 구성을 프로파일에 대한 신속하고 민감한 방법입니다. 이 방법은 lectins, 수용체, 그리고 항체 16와 같은 glycan 결합 단백질과 탄수화물의 상호 작용 높은 처리량 검사에 대해 이미 사용 가능한 박테리아 나 포유류의 glycan 배열 플랫폼을 보완합니다. 세포 벽 glycans를 검출하기위한 가능한 프로브의 큰 다양성으로,이 식물 세포 벽의 8,9?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IEM은 자금 덴마크 연구위원회 (FTP 및 FNU)을 인정하고 싶습니다. ERL은 ARC DP 교부금의 지원을 인정합니다. AB는 식물 세포 벽의 부여에 우수의 ARC 센터의 지원을 인정한다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diaminoethane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water & process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) – Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
Referências
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