Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays
Summary
Una técnica llamada<strong> C</strong> Omprehensive<strong> M</strong> Icroarray<strong> P</strongProfiling> olymer (CoMPP) para la caracterización de los glicanos la pared celular vegetal se describe. Este método combina la especificidad de los anticuerpos monoclonales dirigidos a epítopos definidos glicano con una miniatura plataforma de microarrays analítico que permite detección de la ocurrencia de glicanos en una amplia gama de contextos biológicos.
Abstract
Paredes celulares de las plantas son matrices complejas de los glicanos heterogéneos, que desempeñan un papel importante en la fisiología y el desarrollo de las plantas y proporcionar las materias primas para las sociedades humanas (por ejemplo, industrias de la madera, papel, textiles y de biocombustibles) 1,2. Sin embargo, la comprensión de la biosíntesis y función de estos componentes sigue siendo un reto.
Glucanos de la pared celular son químicamente y conformacionalmente diversa debido a la complejidad de sus bloques de construcción, los residuos de glicosilo. Estos forman uniones en las posiciones múltiples y difieren en estructura de anillo, configuración isomérica o anomérico, y además, están sustituidos con una matriz de no azúcar residuos. Glycan composición varía en células diferentes y / o tipos de tejidos o incluso sub-dominios de una sola célula de la pared 3. Además, su composición también se modifica durante el desarrollo 1, o en respuesta a señales ambientales 4.
En exproceso de 2.000 genes tienen paredes celulares de las plantas son matrices complejas de los glicanos heterogéneos ha previsto que participen en la biosíntesis de la pared celular y la modificación de glicanos en Arabidopsis 5. Sin embargo, relativamente pocos de los genes biosintéticos se han caracterizado funcionalmente 4,5. Ida y enfoques de genética son difíciles debido a que los genes son a menudo expresados diferencialmente, a menudo a niveles bajos, entre los tipos de células 6. Además, los estudios mutantes son a menudo obstaculizado por la redundancia de genes o mecanismos compensatorios para asegurar el funcionamiento adecuado de la pared celular se mantiene 7. Así, nuevos enfoques son necesarios para caracterizar rápidamente la diversa gama de estructuras de glucanos y para facilitar enfoques de la genómica funcional para la biosíntesis de la pared celular y la comprensión modificación.
Los anticuerpos monoclonales (mAbs) 8,9 han surgido como una herramienta importante para determinar la estructura de glicano y distribución en las plantas. En ellos se reconoce distINCT presentes dentro de las principales categorías de glicanos la pared celular vegetal, incluidas las pectinas, xiloglucanos, xilanos, mananos, glucanos y arabinogalactanos epítopos. Recientemente su uso se ha extendido a los experimentos de cribado a gran escala para determinar la abundancia relativa de los glicanos en una amplia gama de plantas y tipos de tejidos simultáneamente 9,10,11.
Aquí presentamos un método basado en micromatrices glicano exploración llamada integral Microarray de perfiles de polímero (CoMPP) (Figuras 1 y 2) 10,11 que permite múltiples muestras (100 segundos) para ser seleccionados utilizando una plataforma de microarrays miniaturizado con reactivo reducida y volúmenes de muestra. Las señales de punto del microarray puede ser formalmente cuantificados para dar semi-cuantitativos de los datos sobre la ocurrencia glycan epítopos. Este método es muy adecuado para el seguimiento de los cambios en glicanos complejos sistemas biológicos 12 y que proporciona una visión global de la composición de la pared celular en particular cuando el conocimiento previo of este no estará disponible.
Protocol
Representative Results
Discussion
CoMPP es un método rápido y sensible para perfilar la composición glicanos de cientos de plantas derivadas de las muestras en cuestión de días. Este método complementa las plataformas de glicano ya disponibles bacterianas o de mamíferos de matriz para cribado de alto rendimiento de las interacciones de hidratos de carbono con glicanos de proteínas de unión tales como lectinas, receptores, y anticuerpos 16. Con una gran diversidad de sondas disponibles para la detección de glucanos de la pared celula…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IEM gustaría reconocer el Consejo Danés de Investigación (FTP y FNU) para su financiación. ERL reconoce el apoyo de una subvención de ARC DP. AB reconoce el apoyo del Centro ARC de Excelencia en Plant Cell Paredes subvención.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diaminoethane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water & process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) – Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
Referências
- Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
- Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
- Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
- Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
- Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
- Sarria, R., Wagner, T. A., O’Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
- Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
- Willats, W. G. T., Knox, J. P., Rose, J. K. C. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. , 92-110 (2003).
- Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
- Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
- Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
- Moller, I. E., Licht, D. e. F. i. n. e., Harholt, H. H., J, , et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506 (2011).
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , (2012).
- Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
- Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
- McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
- Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
- Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
- Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
- 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
- Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
- Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
- Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
- Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).
