Glykan Profilering av växtcellväggnedbrytande Polymerer med Microarrays
Summary
En teknik som kallas<strong> C</strong> Omprehensive<strong> M</strong> Icroarray<strong> P</strong> Olymer Profilering (CoMPP) för karakterisering av växtcellväggnedbrytande glykaner beskrivs. Denna metod kombinerar för monoklonala antikroppar riktade mot definierade glykan-epitoper med en miniatyr microarray analys plattform möjliggör screening av glykan händelse i ett brett spektrum av biologiska sammanhang.
Abstract
Växt cellväggar är komplexa matriser av heterogena glykaner som spelar en viktig roll i fysiologi och utveckling av växter och ge råvaror för mänskliga samhällen (t.ex. trä, papper, textil-och biobränsle industri) 1,2. Men förstå biosyntes och funktion av dessa komponenter förblir utmanande.
Cellvägg glykaner är kemiskt och konformationellt olika beroende på komplexiteten i deras byggstenar, de glykosylrester. Dessa bildar bindningar vid flera positioner och skiljer sig i ringstruktur, isomer eller anomeriska konfigurationen, och dessutom är substituerade med en grupp av icke-sockerrester. Glykan sammansättning varierar i olika cell-och / eller typer vävnad eller sub-domäner av en enda cell vägg 3. Dessutom är deras sammansättning också ändras under utveckling 1, eller som svar på miljö-signaler 4.
I excess av 2.000 gener har växt cellväggar är komplexa matriser av heterogena glykaner förutsagts vara inblandade i cellväggen glykan biosyntes och modifiering i Arabidopsis 5. Emellertid har relativt få av de biosyntetiska gener funktionellt karaktäriseras 4,5. Omvänd genetik metoder är svårt eftersom generna ofta är differentiellt uttryckta, ofta vid låga nivåer, mellan celltyper 6. Dessutom är muterade studier ofta hindras av gen redundans eller kompenserande mekanismer för att garantera lämplig cellväggen funktion bibehålls 7. Således nya metoder behövs för att snabbt karakterisera många olika glykanstrukturer och underlätta funktionsgenomiska metoder för att förstå cellväggsbiosyntes och modifiering.
Monoklonala antikroppar (mAbs) 8,9 har dykt upp som ett viktigt verktyg för att bestämma glykan struktur och fördelning i växter. Dessa erkänner distINCT epitoper som finns inom huvudklasser av växtcellväggnedbrytande glykaner, inklusive pektiner, xyloglucans, xylaner, mannaner, glukaner och arabinogalactans. Nyligen deras användning har utvidgats till storskalig screening experiment för att bestämma den relativa förekomsten av glykaner i ett brett spektrum av växt-och vävnadstyper samtidigt 9,10,11.
Här presenterar vi en microarray-baserade glykan screening metod som kallas Omfattande Microarray Polymer Profilering (CoMPP) (figur 1 och 2) 10,11 som gör att flera prover (100 sek) kan ses med en miniatyriserad microarray-plattform med minskad reagens och volymerna prov. De platsen signaler på microarray formellt kan kvantifieras för att ge semi-kvantitativa data om glykan epitop händelse. Detta tillvägagångssätt är väl lämpad att spåra glykan förändringar i komplexa biologiska system 12 och ger en helhetsbild av cellväggen sammansättning särskilt när förkunskaper of detta är tillgänglig.
Protocol
Representative Results
Discussion
CoMPP är en snabb och känslig metod för profilering av glykan sammansättningen av hundratals vegetabiliska prover i några dagar. Denna metod kompletterar de redan tillgängliga bakterie-eller däggdjursceller glykan array plattformar för high-throughput screening av kolhydrater interaktioner med glykan-bindande proteiner såsom lektiner, receptorer och antikroppar 16. Med en stor mångfald av prober tillgängliga för detektion glykaner cellväggen, är det möjligt att få detaljerad information om gly…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IEM skulle vilja erkänna det danska forskningsrådet (FTP och FNU) för finansiering. ERL erkänner stöd av en ARC DP bidrag. AB erkänner stöd av ARC Centre of Excellence i Plant cellväggar bidrag.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diaminoethane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water & process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) – Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
Referências
- Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
- Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
- Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
- Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
- Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
- Sarria, R., Wagner, T. A., O’Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
- Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
- Willats, W. G. T., Knox, J. P., Rose, J. K. C. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. , 92-110 (2003).
- Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
- Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
- Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
- Moller, I. E., Licht, D. e. F. i. n. e., Harholt, H. H., J, , et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506 (2011).
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , (2012).
- Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
- Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
- McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
- Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
- Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
- Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
- 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
- Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
- Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
- Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
- Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).
