Profiling Glycan dei polimeri cellula vegetale da parete usando i microarrays
Summary
Una tecnica chiamata<strong> C</strong> Omprehensive<strong> M</strong> Icroarray<strong> P</strongOlymer> Profiling (CoMPP) per la caratterizzazione dei glicani della parete delle cellule vegetali è descritto. Questo metodo combina la specificità degli anticorpi monoclonali diretti ad epitopi definiti glicano-miniatura con una piattaforma microarray analisi di screening che consente di occorrenza glicano in un'ampia gamma di contesti biologici.
Abstract
Pareti delle cellule vegetali sono matrici complesse di glicani eterogenee che svolgono un ruolo importante nella fisiologia e sviluppo di impianti e di fornire le materie prime per le società umane (ad esempio, industria del legno, della carta, tessile e biocarburanti) 1,2. Tuttavia, la comprensione la biosintesi e la funzione di tali componenti rimane difficile.
Glicani parete cellulare sono chimicamente e conformazione diversa a causa della complessità dei loro elementi costitutivi, i residui di glicosil. Questi legami modulo in più posizioni e differiscono in struttura ad anello, configurazione isomerica anomerico, e in aggiunta, sono sostituiti con un array di non-zucchero residui. Glicano composizione varia in cella e / o tipi di tessuto o anche sottodomini di una singola cella parete 3. Inoltre, la composizione è anche modificato durante lo sviluppo 1, o in risposta a stimoli ambientali 4.
In excesso di 2.000 geni hanno pareti cellulari vegetali sono matrici complesse di glicani eterogenei stati previsti di essere coinvolti nella biosintesi della parete cellulare glicano e la modifica in Arabidopsis 5. Tuttavia, relativamente pochi dei geni biosintetici sono stati caratterizzati funzionalmente 4,5. Reverse approcci genetica sono difficili perché i geni sono spesso differenzialmente espressi, spesso a livelli bassi, tra i tipi di cellule 6. Inoltre, gli studi mutanti sono spesso ostacolati da ridondanza genica o meccanismi di compensazione per garantire un'adeguata funzione della parete cellulare è mantenuta 7. Così nuovi approcci sono necessari per caratterizzare rapidamente la vasta gamma di strutture glycan e per facilitare approcci di genomica funzionale per la biosintesi della parete cellulare comprensione e la modifica.
Gli anticorpi monoclonali (mAb) 8,9 sono emersi come un importante strumento per definire l'assetto glicano e la distribuzione negli impianti. Questi riconoscono distepitopi inct presenti all'interno di classi principali di glicani delle cellule delle piante da parete, comprese le pectine, xyloglucans, xylans, mannani, glucani e arabinogalactans. Recentemente il loro uso è stato esteso a grandi esperimenti di screening per determinare la quantità relativa di glicani in una vasta gamma di tipi di tessuto vegetale e contemporaneamente 9,10,11.
Qui vi presentiamo un microarray basato su metodo di screening glicano chiamato completa Microarray Profiling Polymer (CoMPP) (Figure 1 e 2) 10,11 che consente più campioni (100 sec) per essere schermati con una piattaforma microarray miniaturizzato con il reagente ridotta e volumi di campione. I segnali piatte su microarray può essere formalmente quantificato per dare semi-quantitativi i dati relativi verificarsi glicano epitopo. Questo approccio è adatto per tenere traccia delle modifiche glycan in sistemi biologici complessi 12 e fornendo una visione globale della composizione della parete cellulare in particolare quando prima conoscenza of questo non è disponibile.
Protocol
Representative Results
Discussion
CoMPP è un metodo rapido e sensibile per la profilatura della composizione glicano di centinaia di piante derivate da campioni in una questione di giorni. Questo metodo integra le piattaforme di batteri o mammiferi già disponibili matrice glycan for high-throughput screening di interazioni di carboidrati composti da glicano proteine leganti, come lectine, recettori e anticorpi 16. Con una grande diversità di sonde disponibili per rilevare glicani parete cellulare, è possibile ottenere informazioni d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IEM desidera ringraziare il Danish Research Council (FTP e FNU) per il finanziamento. ERL riconosce il sostegno di un DP ARC sovvenzione. AB riconosce il sostegno del Centro di Eccellenza in ARC Plant Cell sovvenzione Mura.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diaminoethane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water & process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) – Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
Referências
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