Studieren Proteolyse von Cyclin B an der Single Cell Level in Whole Cell Populationen
Summary
Metaphase zur Anaphase Übergang durch Anaphase-promoting complex (APC / C)-abhängige Ubiquitinierung und anschließende Zerstörung von Cyclin B. Hier haben wir ein System, das Pulse-Chase-Kennzeichnung nach, ermöglicht die Überwachung Cyclin B Proteolyse im gesamten Zellpopulationen und wird ausgelöst, erleichtert den Nachweis von Störungen durch den mitotischen Checkpoint.
Abstract
Gleichmäßige Verteilung der Chromosomen auf die beiden Tochterzellen bei der Zellteilung ist eine Voraussetzung für die Gewährleistung der genetischen Stabilität 1. Ungenauigkeiten bei der Trennung der Chromosomen sind ein Markenzeichen der Bösartigkeit und mit fortschreitender Erkrankung 2-4. Die Spindelanordnung Prüfpunkt (SAC) eine mitotische Überwachungsmechanismus zurückhält, die Zellen in der Metaphase bis jeder einzelnen Chromosom eine stabile Befestigung an der bipolaren mitotischen Spindel 1 hergestellt wurde. Der SAC übt seine Funktion durch Interferenz mit der aktivierenden APC / C-Untereinheit Cdc20 Proteolyse des Securin und Cyclin B und damit Trennung der Chromosomen und mitotische Ausfahrt blockieren. Bei unsachgemäßer Befestigung von Chromosomen verhindert Silencing SAC-Signalisierung und führt fort Hemmung der APC / C Cdc20, bis das Problem behoben ist auf Chromosom missegregation, Aneuploidie und bösartigen Neubildungen 1 zu vermeiden.
Die meisten Studien, die die i adressiertnfluence unsachgemäßer chromosomale Befestigung an APC / C-abhängige Proteolyse nutzte der Spindel Störungen mit Depolymerisation oder Mikrotubuli-stabilisierende Medikamente mit chromosomalen Bindung an Mikrotubuli stören. Da Störungen Mikrotubuli Kinetik des Transports und Lokalisierung der kritischen Regulatoren beeinflussen können, tragen diese Verfahren ein Risiko der Induktion künstliche Effekte 5.
Um zu untersuchen, wie die SAC mit APC / C-abhängige Proteolyse von Cyclin B stört während der Mitose in ungestörten Zellpopulationen, haben wir ein Histon H2-GFP-basiertes System, das erlaubt die gleichzeitige Überwachung von Metaphase Ausrichtung der mitotischen Chromosomen und Proteolyse von Cyclin B 6 .
Einen proteolytischen Profile darstellen, erzeugten wir eine chimäre Cyclin B Reportermolekül mit einem C-terminalen SNAP-Einheit 6 (Abbildung 1). In einem Self-Labelling Reaktion ist der SNAP-Einheit in der Lage, kovalente Bindungen mit bildenAlkylguanin-Trägern (SNAP Substrat) 7,8 (Abbildung 1). SNAP Substratmolekülen sind leicht verfügbar und führen ein breites Spektrum verschiedener Fluorochrome. Chimäres Cyclin B-SNAP-Moleküle geworden markierten bei Zugabe des Membran-permeablen Substrat SNAP zum Wachstumsmedium 7 (Abbildung 1). Nach der Markierungsreaktion sinkt die Cyclin B-SNAP Fluoreszenzintensität in einem Puls-Chase-Reaktion-artig und Fluoreszenzintensitäten reflektieren Ebenen von Cyclin B Abbau 6 (Abbildung 1). Unserem System erleichtert die Überwachung der mitotischen APC / C-abhängige Proteolyse in einer großen Anzahl von Zellen (oder mehrere Zellpopulationen) parallel. Dabei kann das System ein wertvolles Werkzeug, um Agenten / kleine Moleküle, die in der Lage, mit proteolytischer Aktivität in der Metaphase stören den Übergang Anaphase zu identifizieren sein. Darüber hinaus hat die Synthese von Cyclin B während der Mitose kurzem als wichtiges mechanis vorgeschlagen wordenm bei der Förderung eines mitotischen Block in Mäusen und Menschen, indem sie Cyclin B Expression stabiler 9,10, aktiviert dieses System uns Cyclin B Proteolyse als ein Element eines ausgewogenen Gleichgewichts 6 analysieren.
Protocol
Discussion
Wir stellen Ihnen hier eine Live-Cell-Imaging-basierten Ansatz erleichtert die gleichzeitige Überwachung von Cyclin B Proteolyse und Chromosom Ausrichtung. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der mitotischen Kontrolle in ungestörten Zellpopulationen an der einzelnen Zelle. Cyclin B Abbaukurven erleichtern direkten Einblick in die Aktivität des APC / C und damit indirekt geben den Status des SAC 6.
Dieser Ansatz, obwohl gegründet basierend auf dem Scan ^ R-Software, kann…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar, S. Taylor für die Bereitstellung der pLPCX-Histone H2-GFP-Plasmid. Wir danken R. Mertelsmann für die kontinuierliche Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft unterstützt.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Reporter cell line | generated in-house as described 6 | clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells) |
|
| Retroviral cyclin B-SNAP expression vector | generated in-house as described 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
| Phenolred-free DMEM | Gibco | 21063-029 | Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required |
| SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Stock solution 400 μM in DMSO |
| Special Opstics Plate, 96 well | Costar | 3720 | |
| μ-Slide 8 well, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
| Microscopy unit | Olympus | IX-81 inverse microscope with climate chamber | |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75) | |
| Acquisition software | Olympus | Scan^R Acquisition software (v.2.2.09) | |
| Analysis software | Olympus | Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6) |
Referências
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