Modification des surfaces chimiosélective virales via Click Chemistry Bioorthogonal
Summary
Particules d'adénovirus sont conçus pour contenir soit le naturel azidohomoalanine analogue d'acide aminé ou le sucre azido<em> O</em>-GlcNAz. Le groupe azide de chaque chimiosélective est ligaturé au moyen des réactions «clic» chimie sous forme de moyens de modification de surface virale.
Abstract
La modification de particules virales a reçu une quantité importante de l'attention pour son énorme potentiel pour influer sur la thérapie génique, applications oncolytiques et le développement de vaccins. 1,2,3 Les approches actuelles de la modification de surfaces virales, qui sont la plupart du temps basée sur la génétique, souffrent souvent de l'atténuation transduction de la production de virus, d'infectiosité et cellulaire. 4,5 En utilisant la chimie clic chimiosélective, nous avons développé une approche alternative simple qui permet d'éviter ces problèmes tout en restant à la fois très souple et accessible. 1,2
L'objectif de ce protocole est de démontrer l'efficacité de l'aide click chemistry bioorthogonal de modifier la surface de l'adénovirus de type 5 particules. Ce processus en deux étapes peut être utilisé à la fois thérapeutique 1 ou analytiquement, 2,6, car il permet pour la ligature chimiosélective de molécules de ciblage, de colorants ou d'autres molécules d'intérêt sur des protéinespré-marquée avec balises azide. Les trois principaux avantages de cette méthode sont que (1) marquage métabolique démontre peu ou pas d'impact sur l'aptitude virale, 1,7 (2) un large éventail de ligands effecteurs peuvent être utilisés, et (3), il est remarquablement rapide, fiable et facile d'accès. 1,2,7
Dans la première étape de cette procédure, les particules d'adénovirus sont soit produite portant azidohomoalanine (Aha, un substitut méthionine) ou le sucre non naturelle O-liée N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), qui contiennent tous deux l'azoture (-N 3) fonctionnelle groupe. Après purification des particules virales azoture modifiés, une sonde alcyne contenant le fragment fluorescent TAMRA est ligaturé de manière chimiosélective aux protéines pré-étiquette ou glycoprotéines. Enfin, une analyse SDS-PAGE est effectuée pour démontrer la ligature réussi de la sonde sur les protéines de la capside virale. L'incorporation Aha est montré à étiqueter tous les capside viraleprotéines (Hexon, Penton et fibre optique), tandis que les résultats d'incorporation O-GlcNAz dans l'étiquetage des fibres seulement.
Dans ce domaine en pleine évolution, de multiples méthodes pour l'azoture de-alcyne ligature ont été développés avec succès, mais seuls les deux nous avons trouvé pour être plus pratique sont mises en évidence ci – souche promu azide-alcyne cycloaddition (SPAAC) et de cuivre-catalysée azide-alcyne cycloaddition (CuAAC) sous atmosphère désoxygénée.
Protocol
Discussion
Le développement de la réactions cliquez sur chimiosélectives et de bioorthogonal, y compris ceux de la des azides, des est un zone de rapidement-en évolution de la recherche, et par la suite il n'y a un certain nombre croissante de ces réactions de choisir à partir pour les applications bioconjugaison. Nous avons limité la portée de ce protocole d'inclure seulement deux méthodes qui ont été choisis en raison de leur utilité dans notre propre laboratoire et de la disponibilité commerciale de tous le…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier la NSF pour le financement (CBET-0846259).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 |
| Penicillin – Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 |
| Cell culture CO2 incubator | ||
| Hemocytometer | ||
| Biosafety cabinet | ||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | |
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 |
| Sterile needle, 18 gauge | ||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | ||
| Dewar flask | ||
| Liquid nitrogen | ||
| Electrophoresis cell | ||
| Fluorescent gel scanner | ||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | |
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 |
| Thermo Scientific | 88905 | |
| Sigma-Aldrich | A7480 | |
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ||
| Methanol | ||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | ||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ||
| 1M HCl | ||
| Glycerol | ||
| Bovine Serum Albumin | ||
| L-cysteine | ||
| L-methionine | ||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | ||
| 2-mercaptoethanol | ||
| Glycine | ||
| Bromophenol blue | ||
| Cesium Chloride (CsCl) | ||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | ||
| Potassium Chloride (KCl) | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | ||
| Alkyne probe for CuAAC* | ||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | ||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors’ catalogs.
Referências
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