Høy gjennomstrømning Sekvensiell ELISA for validering av biomarkører for akutt transplantat-mot-vert-sykdom

Summary

Høy gjennomstrømning validering av flere kandidater biomarkører kan utføres ved sekvensiell ELISA for å minimere fryse / tine sykluser og bruk av edle plasmaprøver. Her viser vi hvordan du sekvensielt utføre ELISAs for seks ulike validerte plasma biomarkører^1-3 Av graft-versus-host sykdom (GVHD)⁴ På samme plasmaprøve.

Abstract

Objektive funn proteomikk strategier har potensial til å identifisere et stort antall nye biomarkører som kan forbedre diagnostisk og prognostisk testing i en klinisk setting, og kan hjelpe guide terapeutiske intervensjoner. Når store mengder kandidat proteiner er identifisert, kan det være vanskelig å validere kandidat biomarkører i en rettidig og effektiv måte fra plasmaprøver som er hendelsesstyrt, av endelig volum og uerstattelig, for eksempel ved utbruddet av akutt transplantat-mot- vert-sykdom (GVHD), en potensielt livstruende komplikasjon av allogen hematopoietisk stamcelletransplantasjon (HSCT).

Her beskriver vi prosessen med å utføre kommersielt tilgjengelige ELISA for seks validerte GvHD proteiner: ⁵ IL-2Rα, TNFR1 ^{6, 7} HGF, ^IL-8 8, ² elafin og REG3α ³ (også kjent som PAP1) i en sekvensiell måte for å minimere fryse-tine sykluser, Tint plasma tid og plasma bruk. For denne prosedyren utfører vi ELISAs i kronologisk rekkefølge som bestemmes av prøven fortynningsfaktoren som ble etablert i vårt laboratorium ved hjelp produsenten ELISA kits og protokoller med mindre justeringer for å lette optimal sekvensiell ELISA ytelse. De resulterende plasma biomarkør konsentrasjoner kan deretter bli utarbeidet og analysert for betydelige funn innenfor en pasient kohort. Mens disse biomarkører er for tiden til forskningsformål bare er deres innlemmelse i klinisk arbeid for tiden under etterforskning i kliniske studier.

Denne teknikken kan brukes til å utføre ELISA for flere proteiner / cytokiner av interesse på samme prøve (r) gitt eksempler ikke må blandes med andre reagenser. Hvis ELISA kits ikke kommer med forbelagte plater, 96-brønners halv-brønners plater eller 384-brønners plater kan brukes til ytterligere å redusere bruk av prøver / reagenser.

Introduction

Akutt transplantat-mot-vert-sykdom (GVHD), en ledende årsak til ikke-tilbakefall dødelighet (NRM) etter allogen hematopoietisk stamcelletransplantasjon (HSCT), er målt ved dysfunksjon i tre organsystemer: huden, leveren og gastrointestinale (GI) skrift ^4. Akutt GVHD oppstår vanligvis mellom to og åtte uker etter transplantasjon, men kan oppstå senere, og er ofte klinisk skilles fra andre post-HSCT komplikasjoner som tilvenningskur giftighet, infeksjon eller medisiner bivirkninger. Gjennom bruk av proteomikk strategier og high-throughput godkjenning ved sekvensiell ELISA, har vi identifisert seks proteiner som konsentrasjonene er forhøyet ved utbruddet av kliniske manifestasjoner av GVHD. IL-2Rα, TNFR1, HGF og IL-8, kombinert i en 4-biomarkør panel kan diagnostisere GVHD ved utbruddet av kliniske symptomer og kan forutsi post-HSCT overlevelse uavhengig av GVHD alvorlighetsgrad ^1. Elafin, en biomarkør for GVHD av ski, kan diskriminere mellom GVHD utslett og utslett av andre årsaker som for eksempel narkotika utbrudd og kan forutsi transplantasjon overlevelse ^2. Vi har nylig identifisert REG3α som en biomarkør for GVHD av nedre gastrointestinaltraktus, målorganet mest tilknyttet NRM. Plasma REG3α konsentrasjon kan sikkert identifisere GVHD som årsak for post-HSCT diaré og relateres til histologisk alvorlighetsgrad av GVHD på diagnostiske intestinal biopsi. REG3α konsentrasjoner på GI GVHD utbruddet kan også forutsi respons til GVHD terapi og NRM ^3. Inkorporering av disse validerte GvHD biomarkører i klinisk arbeid blir nå undersøkt i kliniske studier.

Disse forsøk ble utført på liten plasma alikvoter tatt av pasienter som får HSCT mellom 2000 og 2010 på den tiden av GVHD utbruddet som er uerstattelige og begrenset mengde. Grunnet dyrebare natur av disse prøvene, har vi utviklet en Method måle flere plasmaproteiner konsentrasjoner på en effektiv, reproduserbar måte å fjerne overflødig fryse-tine sykluser, tine tid og plasma bruk. Denne teknikken kan brukes til å utføre ELISA for flere proteiner / cytokiner av interesse på samme prøve (r) gitt eksempler ikke må blandes med andre reagenser. Hvis ELISA kits ikke kommer med forbelagte plater, 96-brønners halv-brønners plater eller 384-brønners plater kan brukes til ytterligere å redusere bruk av prøver / reagenser. Dette manuskriptet fokuserer på de teknologiske aspektene ved måling GVHD biomarkører.

Protocol

1. Eksperiment Dag 0: Prøvepreparering og ELISA Test Plate Coating med Capture Antistoff for IL-2Rα, REG3α og HGF Plasma alikvot prøver som skal analyseres, vil bli trukket, tint og sentrifugert ved 12.000 opm i 10 minutter for å skille blodpropp nederst og lipider på toppen fra plasma. 150 pl av ufortynnet plasma vil bli belagt fra hver prøve på en 96-brønners V-bunnplate (kilde plate) ved manuell pipettering i henhold til forhåndsdefinerte kartene. De alikvoter blir omgitt parafilm og holdt i et fuktig kammer ved 4 ° C under hele prosessen, ikke lenger enn 72 timer. IL-2Rα og HGF fangst antistoffer vil bli rekonstituert og fortynnet produsentens angivelse og 50 pl vil belagt i hver brønn av 96-brønns respektive høy-bindende halv-brønns plater som deretter forseglet og inkubert over natten ved 4 ° C. Alternativt kan mange platene tørkes ved 37 ° C og lagret ved 4 ° C for senere bruk, avhengeing på stabiliteten av proteinet. REG3α fangst antistoff vil bli fortynnet i henhold til produsentens protokoll ved hjelp produsent belegg buffer og 25 pl vil bli belagt i hver brønn av en 384-brønners Nunc Maxi-Sorp plate som deretter blir forseglet og inkubert over natten ved 4 ° C. 2. Eksperiment Dag 1: IL-2Rα ELISA (figur 1) IL-2Rα testplaten er vasket, blokkert med BLOTTO i TBS, og standard rekonstitueres og en 8-punkts standardkurve fremstilles per produsentens protokoll. Etter vasking av platen etter den blokkerende trinnet ble 50 pl ufortynnet plasma belagt i duplikat fra kilden plate til ELISA testplaten, og 50 pl av hver standard er belagt i duplikat. Platen er forseglet og inkubert i 2 timer ved romtemperatur på en plate rotator innstilt på 300 rpm. Plasma er gjenvunnet fra IL-2Rα ELISA test plate og plassert tilbake i unfortynnet plasma kilde plate. ELISA er fullført i henhold til produsentens protokoll (med volumer justert for halv-brønners plater) og den optiske tettheten til hver brønn blir lest ved hjelp av en plate-leser sett til 450-570 nm, og dataene lagres og analyseres. 3. Eksperiment Dag 1: REG3α ELISA (Figur 1) 10 pl ufortynnet plasma vil bli overført til en separat v-bunn kilde plate. 90 pl av produsent-tilgjengelig fortynningsbuffer blir tilsatt til hver brønn for å opprette en 1:10 fortynning kilde plate. Den REG3α ELISA utføres per produsentens protokoll (med volumer justert for 384-brønners plater) og den optiske tettheten til hver brønn blir lest ved hjelp av en plate-leser satt til 450-620 nm, og dataene lagres og analyseres. 4. Eksperiment Dag 1: Elafin og TNFR1 Test Plate Coating med Capture Antistoff Elafin og TNFR1 fangst antistoffer vil være rekonstituert og diluted per produsentens angivelse og 50 pl vil belagt i hver brønn av 96-brønns respektive høy-bindende halv-brønns plater som deretter forseglet og inkubert over natten ved romtemperatur i Elafin, og ved 4 ° C i TNFR1. 5. Eksperiment Dag 1-2: HGF ELISA (Figur 1) Etter endt IL-2Rα ELISA og sikre testen ikke trenger å bli gjentatt, vil 60 ul ufortynnet plasma overføres til en ny kilde plate og deretter 60 pl av 1% BSA i 1 x PBS tilsatt til hver brønn for å lage en 01:02 utvannet plasma kilde plate. Den HGF testplaten er vasket, blokkert med BLOTTO i TBS, og standard rekonstitueres og en 8-punkts standardkurve fremstilles per produsentens protokoll. Etter vasking av platen etter den blokkerende trinnet ble 50 pl 1:02 fortynnet plasma belagt i duplikat på ELISA testplaten, og 50 pl av hver standard er belagt i duplikat. Platen er forseglet oginkubert over natten ved romtemperatur på en plate rotator innstilt på 300 rpm. Den 01:02 utvannet plasma er gjenvunnet fra HGF ELISA test plate og plassert tilbake i 01:02 utvannet plasma kilde plate. ELISA er fullført i henhold til produsentens protokoll (med volumer justert for halv-brønners plater) og den optiske tettheten til hver brønn blir lest ved hjelp av en plate-leser sett til 450-570 nm, og dataene lagres og analyseres. 6. Eksperiment Dag 2: Elafin ELISA 10 pl ufortynnet plasma vil bli overført til en ny kilde plate og deretter 190 ul av 1% BSA i 1 x PBS vil bli tilsatt til hver brønn for å gjøre 200 ul plasma dluted 1:20. Den Elafin ELISA som utført i henhold til produsentens protokoll (med volumer justert for halv-brønners plater), og den optiske tettheten til hver brønn blir lest ved hjelp av en plate-leser satt til 450-570 nm, og dataene lagres og analyseres. 7. Eksperiment Day 2: TNFR1 ELISA 25 pl av 1% BSA i PBS blir tilsatt til 01:20 kilden plate (nå inneholdende 100 ul av 1:20 plasma) for å oppnå 125 pl 1:25 fortynnede plasma. Den TNFR1 ELISA er fullført i henhold til produsentens protokoll (med volumer justert for halv-brønners plater) og den optiske tettheten til hver brønn blir lest ved hjelp av en plate-leser satt til 450-570 nm, og dataene lagres og analyseres. 8. Eksperiment Dag 2: IL-8 ELISA 60 pl av 01:02 fortynnet plasma overføres til en ny kilde plate og deretter 180 pl IL-8 fortynningsmiddel tilsatt til hver brønn for å lage en 01:06 utvannet plasmakilde plate. IL-8 ELISA er fullført i henhold til produsentens protokoll (med volumer justert for halv-brønners plater) og den optiske tettheten til hver brønn blir lest ved hjelp av en plate-leser satt til 450-570 nm, og dataene lagres og analyseres. Når alle ELISAs er fullført, uten brukd lager plasma vil bli erstattet i de tinte alikvoter og frosset for senere bruk.

Representative Results

Den biomarkør arbeidsflyt og tidslinjen er beskrevet i Tabell 1 og Tabell 2, henholdsvis. Etter fullført, konsentrasjoner av 6 forskjellige proteiner har nå blitt kvantifisert på samme plasmaprøve ved hjelp av en total på 150 pl av plasma. Plating prøvene i duplikat per test gjør det mulig for intern kvalitetssikring, med CV mindre enn 10% blir optimal. Hvis utfører sekvensiell ELISA på flere plater, konsistente optiske tettheter av høy standard er foretrukket og gir mulighet for forbedret inter-tallerken påliteligheten av målinger, standardkurve ods kan sammenlignes mellom platene å lete vurdere for inkonsekvens i ELISA ytelse (figur 2). Utvikling ganger bruker tetrametylbenzidin kolorimetrisk substrat og høy konsentrasjon ODS observert for hver biomarkører i vårt laboratorium, er oppført i Tabell 3. tp_upload/4247/4247fig1.jpg "alt =" Figur 1 "/> Figur 1. Workflow for IL-2Rα, REG3α og HGF ELISAs. Etter plasmaprøvene har blitt belagt på den IL-2Rα ELISA test platene det gjenvinnes for å gjøre fortynning kilde plater for andre ELISA. For HGF ELISA, er plasma gjenvunnet for å forberede 01:06 fortynning plate for IL-8. Klikk her for større figur . Figur 2. Optisk tetthet for standardkurven av 7 ulike ELISA plater måler REG3α konsentrasjoner som tilsvarer de 1084 pasientene som ble testet for første REG3α GI GVHD biomarkør rapport 3. Konsekvent ODS mellom platene sikre konsistente protein konsentrasjonsmålinger mellom platene. Konsentrasjoner av proteineri plasma prøvene beregnes ved å sammenligne prøve optiske tettheter til standardkurven optiske tettheter. Eksperiment Dag 0 1. Forbered prøver 2. IL-2Rα, HGF og REG3α fangst Ab Eksperiment Dag 1 1. IL-2RαELISA 2. REG3αELISA 3. HGF ELISA (gjennom prøven plating) 4. Elafin og TNFR fangst Ab Eksperiment Dag 2 1. HGF ELISA ferdigstillelse 2. Elafin ELISA 3. TNFR1 ELISA 4. IL-8 ELISA 5. Refreeze ubruktplasma Tabell 1. GVHD Biomarker Workflow Oversikt Dag 0 Prøveopparbeidelse og overnatting fangst kroppen inkubasjon ELISA IL-2Rα REG3α HGF Elafin TNFR1 IL-8 Tid (t) 0.0 Blokkering 1.0 Prøver Plated <td> 3.0 Reclaim plasmaprøver; Detection Ab Blokkering, forbered Samples (1:10 fortynning) 4.0 Prøver belagt (1:10) 5.0 Streptavidin-HRP Deteksjon Ab 5.5 TMB Streptavidin-HRP 6.0 Plate Reading TMB Blokkering, forbered prøver (01:02 fortynning) 6.5 Plate Reading 7.0 Prøver belagt (1:2) Capture Ab (inkubering over natten) Capture Ab (inkubering over natten) Dag 2 Tid (t) 0.0 Reclaim plasma, Detection Ab Blokkering, forbered prøver (1:20) 1.0 Eksempel plating (1:2) Blokkering; Videre fortynning av 1:20 prøver til 1:25 fortynning 2.0 HRP Eksempel plating (1:25) 2.5 TMB 3.0 Plate Reading Deteksjon Ab 3.5 Forbered prøver (01:06 fortynning) 4.0 Deteksjon Ab Eksempel plating (1:6) 5.0 HRP 5.5 TMB 6.0 Plate Reading </td> HRP Deteksjon Ab TMB 7.0 Plate Reading TMB 7.5 Plate lesing Etter ferdigstillelse Erstatt kilde plasma inn alikvoter og fryse til senere bruk Tabell 2. Timeline for å utføre ELISAs. Plasma Fortynningsfaktor Høy Standard Konsentrasjon Substrat Development Tid (min) Høy OD Kurven IL-2Rα 01:01 2000 pg / ml 5 1 Lineær HGF 01:02 4000 pg / ml 22 2.1 4-parameter IL-8 01:06 200 pg / ml 12 2.7 4-parameter REG3α 01:10 100 ng / ml 12 1.7 4-parameter Elafin 01:20 2000 pg / ml 20 1.9 4-parameter TNFR1 01:25 800 pg / ml 8 2.7 Lineær Tabell 3. ELISA Detaljer for 6 GVHD biomarkører.

Discussion

Den sekvensielle ELISA metoden presentert her tillater måling av flere plasmaproteiner på små volumer av plasma som kan være vanskelig å oppnå og / eller uerstattelige eksempel prøver fra humane individer med sjeldne sykdommer eller plasmaprøver oppnådd fra mus ^9,10. De sekvensielle ELISAs er vanligvis utføres i rekkefølgen av økende plasma fortynningsfaktor med ELISA krever plasma fortynnet ≥ 1:10 vanligvis ikke ønsker å bli gjenvunnet, selv om dette kan gjøres hvis det er ønskelig. Evnen til å utføre sekvensiell ELISA er begrenset av ELISA kits / protokoller hvor plasma er blandet med andre reagenser eller som annen fortynning buffere kreves for plasma, dette utelukker ablility å gjenbruke en prøve på grunn av bekymring for at en inkompatibel buffer / reagens vil forstyrre med utføringen av en bestemt test. Med nøye planlegging, kan 10 eller flere ELISAs utføres på samme plasmaprøve.

ENT "> Individuelle laboratorier må kanskje justere plasma fortynninger for å ha interpretable resultater basert på forventet plasmakonsentrasjoner av proteinet av interesse i prøvene fra forsøkspersonene. Forskjeller i laboratorieutstyr kan resultere i behovet for å optimalisere inkubering og kolorimetriske utvikling ganger, antall vask og / eller vask suge ganger for å optimalisere en gitt ELISA.

Å øke høy gjennomstrømningskapasitet og nøyaktighet og til å utføre analyser på en kostnadseffektiv måte, er bruk av en robot væskehåndtering plattform stand analyse på 384 brønner plater og en automatisert plate vaskemaskinen med stabling enhet anbefales. Dette utstyret kan øke nøyaktighet og presisjon av analyser utført av flere brukere, og bidra til å gi konsistens analyse for å redusere inter-og intra-assay variasjon.

Vi brukte sekvensiell ELISA over tilgjengelige multiplex plattformer for to grunner: 1) De fleste avantistoff parene for nye proteiner kan ikke lett være konjugert på perler eller annet materiale, så vel som tidkrevende og dyrt, 2) individuelle ELISA analysene er mer presis enn multiplex microarray eller perler, sekundært til et fravær av kryssreaktivitet ^11. Hvis en pålitelig metode er etablert for å utføre multipleksede, bead-baserte mikromatriser, kan det være i stand til å erstatte den sekvensielle ELISA prosessen, men kan være begrenset av evnen til å konjugere antistoffene til perler og / eller ved antallet av proteiner ønskes analysert.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Human IL-2 R alpha Duoset	R&D Systems	DY223
Human HGF Duoset	R&D Systems	DY294
Human IL-8 OptEIA KIT II	Becton Dickinson	550999
Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit	MBL International	5323
Ab-Match UNIVERSAL Kit	MBL International	5310
Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset	R&D Systems	DY225
Human Trappin-2/Elafin Duoset	R&D Systems	DY1747
96-well polystyrene conical bottom plates	Thermo Scientific	249570	Used for plasma source plates
Costar half-well high-binding 96-well plates	Corning	3690	For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs
Nunc 384-well MaxiSorp plates	Nunc	464718	For REG3α Elisa
HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x	Thermo Scientific	SH30256.02
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated	Fisher Scientific	BP1600-100
Blocker BLOTTO in TBS	Thermo Scientific	37530	Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	Gibco	21600-069	Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs
TMB Peroxide Susbtrate	Kirkegaard and Perry Laboratories	50-76-00
Tween 20	Acros Organics	233362500	Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs
Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	84720	(Diluted to 2N) for stop solution