Микрофлюидных устройство для изучения нескольких различных штаммов
Summary
Мы приведем простой способ получения микрофлюидных устройств, способных применения аналогичных динамических условиях на нескольких различных штаммов, без необходимости в чистой комнате или мягкой литографии.
Abstract
Изучение клеточных реакций на изменения окружающей среды ставит много экспериментальных задач: клетки должны быть отображены в меняющихся условиях, часто в сравнительном порядке. Multiwell пластин, которые обычно используются для сравнения различных штаммов или клеточные линии, но позволяют ограниченный контроль над окружающей средой динамику. Микрофлюидных устройств, с другой стороны, позволяют изысканные динамического контроля над окружающим условиям, но это сложно различить изображение и больше, чем несколько штаммов в них. Здесь мы опишем метод, чтобы легко и быстро производить микрофлюидных устройство, способное применения динамически изменяющимся условиям в нескольких различных штаммов дрожжей в одном канале. Устройство сконструировано и изготовлено простыми средствами, без необходимости для мягкой литографии. Он состоит из Y-формы проточного канала подключен к второму слою укрывательство лунок. Штаммы помещаются в отдельные лунки, и отображаемого в соответствии с точно такой же динамических условиях. Мы демоnstrate использования прибора для измерения ответы белка локализации импульсов питательных изменения в различных штаммов дрожжей.
Introduction
Клетки постоянно реагировать на динамично изменяющейся среде, путем изменения их метаболизма, транскрипционный профиль и клеточных функций. Для изучения этих явлений, методы, которые могут количественно оценить такие изменения необходимы. Один тип отсчета для такого ответа является изменение локализации, связанные со стрессом факторов транскрипции в ответ на питании напряжением.
Микрофлюидных устройств 1 были использованы для динамически манипулировать условиям окружающей среды к клеткам 2-4. Они представляют собой ряд преимуществ для живых клеток: среда клетки могут быть точно управлять и динамически изменяться, клетки могут быть живыми отображаемого во все времена, в том числе во время манипуляций внешних условий, а также минимальные объемы реагента не требуется. Очень простой дизайн для микрофлюидных устройство, позволяющее чередование двух условий, является Y-формы устройства 2. Мы регулярно использовать Y-формы микрофлюидных устройств, которые позволяютприменение динамических изменений в клетках в канале. Мы используем это устройство, чтобы следить локализации изменений флуоресцентно отмеченных связанных со стрессом факторов транскрипции в клетках дрожжей. Мы следуем этим изменениям при изменении условий питания. Например, мы можем предоставить импульса (или серии импульсов) глюкозо-среде, содержащей в течение не-глюкозы среды, в очень тонкой временное разрешение. Часто в таких экспериментах, заинтересован в сравнение ответов различных штаммов клеток (например, различные мутанты, или различные дикие штаммы). Y-образного канала ограничивается одним напряжения в каждом канале – если более чем один штамм используется, не существует простой способ отличить штаммов. Чтобы преодолеть это, разные каналы могут быть использованы. Если мы хотим применить те же условия динамику на нескольких штаммов, мы хотели бы объединить Y-канал концепции с несколькими каналами. Есть две проблемы в реализации этого решения: Это может быть трудно применить тОн же условиях, в то же время для всех каналов, и есть геометрические ограничения на количество Y-каналов, которые могут быть установлены в одном устройстве. Поэтому мы были ищете способ для просмотра нескольких штаммов в одном канале в динамических условиях.
Здесь мы опишем двухслойной микрофлюидных устройство, предназначенное для работы с изображениями нескольких штаммов в одном канале при тех же динамических условиях. Нижний слой состоит из тонких PDMS с рядом отверстий. Этот слой крепится на стекло покровное создания скважины, в котором мы будем размещать различные штаммы, придерживаясь их с конканавалин к стеклу. Второй слой представляет собой Y-формы микрофлюидных устройство создается с помощью метода скотч 5. После размещения деформаций в скважинах второй слой быстро выравнивается и прикреплена к первой, создавая один канал с несколькими скважинами, которые содержат различные штаммы. Это окончательное устройство позволяет после нескольких штаммов в одном канале, где всештаммы подвергают тех же условиях, в то же самое время. Весь дизайн и процесс производства может быть сделано по крышке, используя простые средства, без мягкой литографии.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы представляем простой метод для создания настольных микрофлюидных устройство, которое позволяет следующих нескольких штаммов дрожжей одновременно в динамических условиях. После нескольких штаммов в одном канале обеспечивает надежный инструмент для сравнения динами…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YG поддерживает общение с ИБР. В это парень Алон и факультет сотрудник Edmond J . Сафра Центр биоинформатики в Тель-Авивском университете . Это исследование было поддержано грантом ISF 1499/10.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | |
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2″ |
Referências
- Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).
- Paliwal, S. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, 46-51 (2007).
- Bennett, M. R., Hasty, J. Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells. Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters. Chips & Tips. , (2010).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).
