En mikrofluid enhed for at studere flere forskellige stammer
Summary
Vi præsenterer en enkel fremgangsmåde til fremstilling mikrofluidenheder stand til at anvende lignende dynamiske betingelser til flere forskellige stammer, uden behov for et rent rum eller blød litografi.
Abstract
Studiet af celle-reaktioner på miljøforandringer rejser mange eksperimentelle udfordringer: celler skal afbildes under skiftende vilkår, ofte i en sammenlignende måde. Flerbrøndsplader anvendes rutinemæssigt til at sammenligne mange forskellige stammer eller cellelinier, men tillader begrænset kontrol over miljøet dynamik. Mikrofluidenheder, på den anden side giver udsøgt dynamisk kontrol over de omgivende betingelser, men det er udfordrende at billede og skelne mere end nogle få stammer i dem. Her beskriver vi en fremgangsmåde til let og hurtigt at fremstille en mikrofluid anordning, der kan anvende dynamisk skiftende betingelser til flere forskellige gærstammer i en kanal. Anordningen er designet og fremstillet med enkle midler uden behov for blød litografi. Den består af en Y-formet strømningskanal fastgjort til et andet lag, der huser mikrobrønde. Stammerne anbringes i separate mikrobrønde, og afbildet på nøjagtig samme dynamiske betingelser. Vi demonstrate brugen af anordningen for måling af protein-lokalisering reaktioner på impulser af næringsstoffer ændringer i forskellige gærstammer.
Introduction
Celler er konstant at reagere på en dynamisk skiftende miljø, ved at ændre deres stofskifte, transkriptionelle profil og cellulære funktioner. For at undersøge disse fænomener, er metoder, der kan kvantificere sådanne ændringer er nødvendige. En type af udlæsning til sådanne reaktioner er ændringen i lokaliseringen af stressrelaterede transkriptionsfaktorer som reaktion på ernæringsmæssig stress.
Mikrofluidenheder 1 er blevet anvendt til dynamisk at manipulere miljømæssige betingelser til celler 2-4. De præsenterer en række fordele for levende celler: miljøet af cellerne kan styres præcist og dynamisk ændret, celler kan være live-afbildes på alle tidspunkter, også under manipulation af eksterne forhold, og minimale reagens volumener er påkrævet. En meget enkel udformning for en mikrofluid anordning, der tillader veksling mellem to betingelser, er en Y-formet indretning 2. Vi rutinemæssigt bruger Y-formede mikrofluidenheder enheder, der tilladerAnvendelsen af dynamiske ændringer i cellerne i kanalen. Vi bruger denne enhed til at følge lokalisering ændringer i fluorescens mærkede stress relaterede transkriptionsfaktorer i gærceller. Vi følger disse ændringer under skiftende ernæringsmæssige forhold. For eksempel kan vi tilvejebringe en impuls (eller række af impulser) i glucose-holdigt medium i løbet af no-glucose medium ved en meget fin tidsmæssig opløsning. Ofte i sådanne forsøg, man er interesseret i at sammenligne responser af forskellige cellestammer (for eksempel forskellige mutanter eller forskellige vilde isolater). Den Y-formede kanal er begrænset til en stamme i hver kanal – hvis der er mere end en stamme der anvendes, er der ingen simpel måde at skelne mellem stammerne. For at overvinde dette, kan forskellige kanaler anvendes. Hvis vi ønsker at anvende de samme dynamik betingelser til flere stammer, vil vi gerne kombinere Y-kanal koncept med flere kanaler. Der er to udfordringer i gennemførelsen af denne løsning: Det kan være svært at anvende tHan samme betingelser på samme tid til alle kanaler, og der er en geometrisk begrænsning af antallet af Y-kanaler, der kan monteres i en enkelt anordning. Vi var derfor på udkig efter en måde til visning adskillige stammer i en kanal under dynamiske forhold.
Her beskriver vi en to-lags mikrofluid anordning beregnet til afbildning af flere stammer i én kanal under de samme dynamiske betingelser. Det nederste lag består af tyndt PDMS med en række huller. Dette lag er fastgjort til dækglas skaber brønde, som vi vil placere de forskellige stammer, klæbe dem med concanavalin A til glasset. Det andet lag er en Y-formet mikrofluid enhed oprettet med tape metode 5. Efter anbringelse af stammerne i brøndene det andet lag hurtigt justeret og fastgjort til den første, hvilket skaber en kanal med flere brønde, der indeholder de forskellige stammer. Denne endelige enhed giver efter flere stammer i én kanal, hvor allestammer underkastes de samme betingelser på samme tid. Hele design-og produktionsprocessen kan gøres på i laboratoriet, med enkle midler, med ingen blød litografi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne afhandling præsenterer vi en simpel benchtop metode til at skabe en mikrofluid enhed, som giver følgende adskillige gærstammer samtidigt under dynamiske forhold. Efter adskillige stammer i en kanal tilvejebringer et pålideligt værktøj til at sammenligne dynamik enkelt celle-responser i flere stammer. Én fordel ved vores metode er evnen til at fremstille enheden med enkle teknikker uden behov for et rent rum. Faktisk har vi også gennemført protokollen springe plasma behandling (i trin 2,9 og 3,6) og fik …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YG understøttes af et fællesskab fra IDB. IN er en Alon fyr og et fakultet Fellow af Edmond J . Safra Center for Bioinformatik ved Tel Aviv University . Denne forskning blev støttet af ISF tilskud 1499/10.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | |
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2″ |
Referências
- Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).
- Paliwal, S. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, 46-51 (2007).
- Bennett, M. R., Hasty, J. Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells. Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters. Chips & Tips. , (2010).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).
