Een microfluïdische apparaat voor het bestuderen van meerdere, afzonderlijke stammen
Summary
We een eenvoudige methode om microfluïdische inrichtingen kunnen toepassen soortgelijke dynamische omstandigheden meerdere verschillende stammen produceren zonder de noodzaak van een clean room of zachte lithografie.
Abstract
De studie van cel responsen op de omgeving vormt vele experimentele problemen: cellen moeten worden afgebeeld onder wisselende omstandigheden, vaak als vergelijkend onderzoek. Putjes en worden routinematig gebruikt om vele verschillende stammen of cellijnen vergelijken, maar laat beperkte controle over de omgeving dynamiek. Microfluïdische apparaten, anderzijds, kunnen uitstekende dynamische controle over de omgevingsomstandigheden, maar het is moeilijk om te onderscheiden afbeelding en meer dan een paar stammen in hen. Hier beschrijven we een methode om gemakkelijk en snel produceren een microfluïdische inrichting kan toepassen dynamisch veranderende omstandigheden meerdere verschillende giststammen in een kanaal. De inrichting is ontworpen en vervaardigd door eenvoudige middelen zonder zachte lithografie. Het bestaat uit een Y-vormige stromingskanaal aan een tweede laag herbergt microwells. De stammen in aparte microwells, en afgebeeld onder exact dezelfde dynamische omstandigheden. We demonstrate het gebruik van de inrichting voor het meten van eiwit lokalisatie reacties op impulsen van voedingsstoffen veranderingen in verschillende giststammen.
Introduction
Cellen worden voortdurend reageren op een dynamisch veranderende omgeving, door hun metabolisme transcriptionele profiel en celfuncties. Om deze fenomenen te bestuderen, zijn methoden die kunnen kwantificeren dergelijke veranderingen nodig zijn. Een soort uitlezing voor deze reacties is de verandering in de lokalisatie van stress gerelateerde transcriptiefactoren in reactie op voeding stress.
Microfluïdische inrichtingen 1 zijn gebruikt om dynamisch omgevingsomstandigheden manipuleren om cellen 2-4. Ze vertonen vele voordelen voor beeldvorming van levende cellen: de omgeving van de cellen nauwkeurig worden gecontroleerd en dynamisch veranderd; cellen live-belichte te allen tijde, ook tijdens manipulatie van externe omstandigheden en minimale reagensvolumes vereist. Een zeer eenvoudige ontwerp voor een microfluïdische apparaat, waardoor afwisseling twee voorwaarden is een Y-vormige inrichting 2. We routinematig gebruik Y-vormige microfluïdische inrichtingen dietoepassing van dynamische veranderingen van de cellen in het kanaal. Wij gebruiken dit apparaat aan localisatie veranderingen van fluorescent gelabeld stress gerelateerde transcriptiefactoren in gistcellen te volgen. We volgen deze veranderingen onder veranderende nutritionele omstandigheden. Zo kunnen wij een puls (of pulstrein) van glucose-bevattend medium binnen no-glucose medium op een zeer fijne tijdsresolutie. Vaak in dergelijke experimenten is men geïnteresseerd in het vergelijken van de reacties van verschillende cellijnen (bijvoorbeeld verschillende mutanten, of verschillende wild isolaten). De Y-vormige goot is beperkt tot een stam in elk kanaal – indien meer dan een stam wordt gebruikt, is er geen eenvoudige manier om onderscheid te maken tussen de stammen. Om dit te ondervangen kunnen verschillende kanalen worden gebruikt. Als we willen dezelfde dynamiek voorwaarden gelden voor meerdere stammen, willen we de Y-kanalen in combinatie met meerdere kanalen. Er zijn twee uitdagingen in de uitvoering van deze oplossing: Het kan moeilijk zijn om t toe te passenhij dezelfde voorwaarden tegelijkertijd alle kanalen, en er is een geometrische beperking van het aantal Y-kanalen worden aangebracht in een apparaat. We waren dan ook op zoek naar een manier voor het bekijken van verschillende stammen in een kanaal onder dynamische omstandigheden.
Hier beschrijven we een tweelaags microfluïdische apparaat voor beeldvorming meerdere stammen in een kanaal onder dezelfde dynamische omstandigheden. De onderste laag bestaat uit dunne PDMS met een rij gaten. Deze laag is aangebracht op de glazen dekglaasje maken putten waarin plaatsen wij de verschillende stammen, hechten ze met Concanavaline A het glas. De tweede laag is een Y-vormige microfluïdische apparaat gemaakt met de plakband methode 5. Nadat de stammen in de putjes de tweede laag snel uitgelijnd en bevestigd aan de eerste, waardoor een kanaal met meerdere putjes die de verschillende stammen bevatten. Deze laatste apparaat maakt na verscheidene stammen in een kanaal, waar allestammen aan dezelfde omstandigheden op hetzelfde moment. Het gehele ontwerp en productieproces kan de stationaire, met eenvoudige middelen, zonder zachte lithografie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel presenteren we een eenvoudige benchtop methode voor het maken van een microfluïdische apparaat dat volgende verschillende giststammen tegelijkertijd laat onder dynamische omstandigheden. Na verscheidene stammen in een kanaal biedt een betrouwbaar instrument voor het vergelijken van de dynamiek van enkele cel responsen in multiple stammen. Een voordeel van onze aanpak is de mogelijkheid om de inrichting te fabriceren met eenvoudige technieken zonder een clean room. In feite hebben we ook uitgevoerd het pr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YG wordt ondersteund door een beurs van IDB. IN is een Alon kerel en een faculteit fellow van de Edmond J . Safra Centrum voor Bio-informatica van Tel Aviv University . Dit onderzoek werd ondersteund door de ISF subsidie 1499/10.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | |
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2″ |
Referências
- Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).
- Paliwal, S. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, 46-51 (2007).
- Bennett, M. R., Hasty, J. Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells. Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters. Chips & Tips. , (2010).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).
