Un dispositivo a microfluidi per lo studio più ceppi distinti
Summary
Presentiamo un metodo semplice per produrre dispositivi microfluidici capaci di applicare simili condizioni dinamiche a più ceppi distinti, senza la necessità di una stanza pulita o litografia morbida.
Abstract
Lo studio delle risposte delle cellule ai cambiamenti ambientali pone molte sfide sperimentali: cellule hanno bisogno di essere ripreso in condizioni mutevoli, spesso in modo comparativo. Piastre multipozzetto sono abitualmente utilizzati per confrontare molti diversi ceppi o linee cellulari, ma permettono un controllo limitato sulle dinamiche ambiente. Dispositivi microfluidici, invece, consentono squisito controllo dinamico delle condizioni ambientali, ma è difficile da immagine e distinguere più di pochi ceppi in loro. Qui si descrive un metodo per produrre facilmente e rapidamente un dispositivo microfluidico in grado di applicare condizioni mutevoli a più ceppi distinti in un canale. Il dispositivo è progettato e costruito in modo semplice senza la necessità di litografia soft. Esso è composto da un canale a forma di Y flusso attaccato ad un secondo strato harboring micropozzetti. I ceppi sono posti in pozzetti separati, e ripreso nelle esatte condizioni dinamiche. Abbiamo demonstrate l'uso del dispositivo per misurare le risposte di localizzazione della proteina di impulsi di cambiamenti nutrienti in differenti ceppi di lievito.
Introduction
Le cellule sono costantemente reagire ad un ambiente in perpetuo cambiamento, cambiando il loro metabolismo, profilo trascrizionale e funzioni cellulari. Per studiare questi fenomeni, metodi che possono quantificare tali cambiamenti sono necessari. Un tipo di lettura di queste risposte è il cambiamento di localizzazione di fattori di trascrizione riferiti sforzo in risposta a stress nutrizionale.
Dispositivi microfluidici 1 sono stati usati per manipolare dinamicamente condizioni ambientali alle cellule 2-4. Essi presentano diversi vantaggi per l'imaging cellulare dal vivo: l'ambiente delle cellule può essere controllato con precisione e dinamicamente cambiato, le cellule possono essere vivo con immagini in qualsiasi momento, anche durante la manipolazione delle condizioni esterne, e volumi di reagente minimi sono obbligatori. Un disegno molto semplice per un dispositivo microfluidico, consentendo alternanza tra due condizioni, è un dispositivo a forma di Y 2. Noi abitualmente uso dispositivi microfluidici a Y che consentonoapplicazione di variazioni dinamiche delle cellule nel canale. Usiamo questo dispositivo per seguire i cambiamenti di localizzazione di etichettati con colori fluorescenti fattori di trascrizione di stress correlati in cellule di lievito. Seguiamo questi cambiamenti nutrizionali in condizioni di instabilità. Per esempio, si può fornire un impulso (o una serie di impulsi) di glucosio contenente terreno entro un periodo di non-glucosio medio, ad una buona risoluzione temporale. Spesso in tali esperimenti, si è interessato a confrontare le risposte dei ceppi cellulari diversi (ad esempio, mutanti diversi, o diversi isolati selvatici). Il canale a forma di Y è limitata ad un ceppo in ogni canale – se più di un ceppo viene utilizzato, non esiste un modo semplice per distinguere tra i ceppi. Per ovviare a questo, i canali possono essere usati diversi. Se vogliamo applicare le stesse condizioni dinamiche a più ceppi, vorremmo combinare la Y-canale concetto con più canali. Ci sono due sfide di implementazione di questa soluzione: Può essere difficile da applicare tegli stesse condizioni contemporaneamente a tutti i canali, e vi è una limitazione geometrica al numero di Y canali che possono essere montati in un unico dispositivo. Abbiamo quindi cercando un modo per visualizzare diversi ceppi in un canale in condizioni dinamiche.
Qui si descrive un doppio strato dispositivo microfluidico destinato ceppi di imaging diversi canali alle stesse condizioni dinamiche. Lo strato inferiore è costituito da sottili PDMS con una fila di fori. Questo strato è attaccato al coprioggetti creando pozzi in cui si collocano i diversi ceppi, aderendo con concanavalina A al vetro. Il secondo strato è una forma di Y dispositivo microfluidico creato utilizzando il metodo scotch 5. Dopo aver posizionato i ceppi nei pozzetti secondo strato è rapidamente allineato e collegato alla prima, creando un canale con diversi pozzi che contengono i diversi ceppi. Questo dispositivo permette finale dopo diversi ceppi in un canale, dove tutticeppi sono sottoposti alle stesse condizioni al tempo stesso esatto. Tutta la progettazione e processo di produzione può essere fatto sul piano del banco, con mezzi semplici, senza litografia morbida.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo presentiamo un metodo semplice da banco per la creazione di un dispositivo a microfluidi che consente i seguenti ceppi di lievito contemporaneamente in condizioni dinamiche. Seguendo diversi ceppi in un canale fornisce uno strumento affidabile per il confronto dinamica di risposte di cellule singole in più ceppi. Un vantaggio del nostro approccio è la capacità di fabbricare il dispositivo con tecniche semplici senza la necessità di una camera pulita. In realtà, abbiamo anche svolto il protocollo …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YG è sostenuto da una borsa di studio IDB. IN è un tipo Alon e membro della facoltà del J Edmond . Safra Centro di Bioinformatica dell'Università di Tel Aviv . Questa ricerca è stata sostenuta da ISF sovvenzione 1499-1410.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | |
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2″ |
Referências
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