En Microfluidic enhet for Studerer Flere Tydelig Stammer
Summary
Vi presenterer en enkel metode for å produsere microfluidic enheter i stand til å anvende lignende dynamiske forhold til flere distinkte stammer, uten behov for et rent rom eller myk litografi.
Abstract
Studiet av celle responser til miljømessige endringer stiller mange eksperimentelle utfordringer: cellene trenger for å bli fotografert under skiftende forhold, ofte i et komparativt måte. Multiwell plater er rutinemessig brukt til å sammenligne mange forskjellige stammer eller cellelinjer, men tillate begrenset kontroll over miljøet dynamikk. Microfluidic enheter, på den annen side, tillater utsøkt dynamisk kontroll over de omkringliggende forhold, men det er utfordrende å bilde og skille mer enn noen få stammer i dem. Her beskriver vi en metode for å enkelt og raskt produsere en microfluidic enhet stand til å anvende dynamisk skiftende forhold til flere forskjellige gjærstammer i én kanal. Enheten er designet og produsert av enkle midler uten behov for myk litografi. Det består av en Y-formet strømningskanal festet til et andre lag harboring mikrobrønner. Stammene er plassert i separate mikrobrønnene, og avbildes under nøyaktig samme dynamiske forhold. Vi demoennstrate bruken av enheten for måling protein lokalisering svar på pulser av næringssalter endringer i forskjellige gjærstammer.
Introduction
Cellene er stadig reagerer på en dynamisk skiftende miljø, ved å endre sin metabolisme, transcriptional profil og cellulære funksjoner. Å studere disse fenomenene, er metoder som kan kvantifisere slike endringer er nødvendig. En type avlesning for slike responser er endringen i lokalisering av stressrelaterte transkripsjonsfaktorer i respons til ernæringsmessig stress.
Microfluidic enheter 1 har blitt brukt til å dynamisk manipulere miljøforholdene celler 2-4. De presenterer flere fordeler for live cell imaging: miljøet av cellene kan kontrolleres nøyaktig og dynamisk endret; celler kan være live-avbildes til enhver tid, også under manipulering av ytre forhold, og minimale reagensvolumene er nødvendig. En meget enkel konstruksjon for en microfluidic enhet, slik alternering mellom to tilstander, er en Y-formet enhet 2. Vi rutinemessig bruk Y-formede microfluidic enheter som tillateranvendelse av dynamiske endringer i cellene i kanalen. Vi bruker denne enheten for å følge lokalisering endringer av fluorescently merket stress relaterte transkripsjonsfaktorer i gjærceller. Vi følger disse endringene under skiftende ernæringsmessige forhold. For eksempel kan vi gi en puls (eller serie av pulser) av glukose-inneholdende medium innenfor en periode av ikke-glukose medium, til en svært fin tidsoppløsning. Ofte i slike eksperimenter, er en interessert i å sammenligne responsene av forskjellige cellestammer (for eksempel ulike mutanter, eller forskjellige wild isolater). Y-formet kanal er begrenset til en belastning i hver kanal – hvis mer enn en stamme blir brukt, er det ingen enkel måte å skille mellom de stammer. For å overvinne dette, kan forskjellige kanaler benyttes. Hvis vi ønsker å bruke de samme dynamikk vilkår som flere stammer, vil vi gjerne kombinere Y-kanalen konsept med flere kanaler. Det er to utfordringer i å implementere denne løsningen: Det kan være vanskelig å bruke than samme betingelser samtidig til alle kanaler, og det er en geometrisk begrensning til antall Y-kanaler som kan monteres i en enhet. Vi var derfor på utkikk etter en måte for visning flere stammer i én kanal under dynamiske forhold.
Her beskriver vi en todelt microfluidic enhet beregnet for imaging flere stammer i en kanal under de samme dynamiske forhold. Det nederste laget består av tynne PDMS med en rekke hull. Dette laget er festet til dekkglass skape brønner inn som vi vil plassere de forskjellige stammer, overholde dem med Concanavalin A til glasset. Det andre laget er en Y-formet microfluidic enhet opprettet med plasteret metoden 5. Etter å ha plassert de påkjenningene i brønnene det andre laget er raskt justert og festet til den første, skaper en kanal med flere brønner som inneholder de forskjellige stammer. Denne siste enheten kan følge flere stammer i én kanal, hvor allestammer er utsatt for de samme forhold på nøyaktig samme tid. Hele design og produksjon prosessen kan gjøres på laboratoriet, ved hjelp av enkle midler, uten myk litografi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen presenterer vi en enkel Borstemmaskin metode for å lage en microfluidic enhet som lar følgende flere gjærstammer samtidig under dynamiske forhold. Etter flere stammer i en kanal gir en pålitelig verktøy for å sammenligne dynamikk encellete responser i flere stammer. En fordel med vår tilnærming er evnen til å dikte enheten med enkle teknikker uten behov for et rent rom. Faktisk har vi også utført protokollen hoppe plasma behandling operasjoner (i trinn 2,9 og 3,6) og fikk gode resultater, s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YG er støttet av et fellesskap fra IDB. IN er en Alon stipendiat og et fakultet medlem av den Edmond J . Safra Center for bioinformatikk ved Tel Aviv University . Denne forskningen ble støttet av ISF stipend 1499-1410.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | |
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2″ |
Referências
- Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).
- Paliwal, S. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, 46-51 (2007).
- Bennett, M. R., Hasty, J. Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells. Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters. Chips & Tips. , (2010).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).
