En mikroflödessystem enheten för att studera flera olika stammar
Summary
Vi presenterar en enkel metod för att producera mikrofluidikanordningar kan tillämpa liknande dynamiska förhållanden till flera olika stammar, utan behov av ett rent rum eller mjuk litografi.
Abstract
Studien av cellsvar på miljöförändringar innebär många experimentella utmaningar: celler måste avbildas under föränderliga förhållanden, ofta i ett jämförande sätt. Flerbrunnsplattor används rutinmässigt för att jämföra många olika stammar eller cellinjer, men tillåter begränsad kontroll över miljön dynamik. Mikroflödessystem enheter, å andra sidan, att utsökt dynamisk kontroll över omgivningen, men det är en utmaning att bild och urskilja mer än några stammar i dem. Här beskriver vi en metod för att enkelt och snabbt tillverka en mikrofluidisk anordning som kan tillämpa dynamiskt föränderliga förhållanden till flera distinkta jäststammar i en kanal. Enheten är designad och tillverkad med enkla medel utan behov av mjuk litografi. Den består av en Y-formad flödeskanal fäst till ett andra skikt hyser mikrobrunnar. Stammarna placeras i separata mikrobrunnar, och avbildas under exakt samma dynamiska förhållanden. Vi demonstrate användningen av anordningen för mätning svar proteinlokalisering till pulser av näringsämnen förändringar i olika jäststammar.
Introduction
Celler ständigt reagera på ett dynamiskt föränderlig miljö, genom att ändra deras metabolism, transkriptionell profil och cellulära funktioner. För att studera dessa fenomen, metoder som kan kvantifiera sådana förändringar som behövs. En typ av avläsning för sådana svar är förändringen i lokaliseringen av stressrelaterade transkriptionsfaktorer som svar på näringsmässig stress.
Mikroflödessystem enheter 1 har använts för att dynamiskt manipulera miljöförhållanden till celler 2-4. De presenterar flera fördelar för levande cell imaging: miljön i cellerna kan kontrolleras exakt och dynamiskt förändrats, celler kan live-avbildas vid alla tillfällen, bland annat vid hantering av externa förhållanden, och minimala reagensvolymer krävs. En mycket enkel konstruktion för en mikrofluidikanordning, tillåter växling mellan två villkor, är en Y-formad anordning 2. Vi använder rutinmässigt Y-formade mikroflödessystem enheter som tillåtertillämpning av dynamiska ändringar av cellerna i kanalen. Vi använder denna enhet för att följa lokalisering förändringar av fluorescerande taggade stressrelaterade transkriptionsfaktorer i jästceller. Vi följer dessa förändringar under föränderliga näringsmässiga förhållanden. Till exempel kan vi erbjuda en puls (eller serie av pulser) av glukos-medium inom en period av-glukos medium vid en mycket fin tidsupplösning. Ofta i sådana experiment, är en intresserad jämföra svaren från olika cellstammar (t.ex. olika mutanter, eller olika vilda isolat). Den Y-formade kanalen är begränsad till en stam i varje kanal – om mer än en stam används, finns det inget enkelt sätt att särskilja mellan stammarna. För att övervinna detta, kan olika kanaler kan användas. Om vi vill använda samma dynamik villkor till flera stammar, vill vi kombinera Y-kanals koncept med flera kanaler. Det finns två utmaningar att genomföra denna lösning: Det kan vara svårt att tillämpa than samma förhållanden samtidigt till alla kanaler, och det finns en geometrisk begränsning av antalet Y-kanaler som kan monteras i en anordning. Vi blev därför söker efter ett sätt för visning flera stammar i en kanal under dynamiska förhållanden.
Här beskriver vi en tvåskiktad mikroflödessystem anordning avsedd för avbildning multipla stammar i en kanal under samma dynamiska förhållanden. Bottenskiktet består av tunt PDMS med en rad av hål. Detta lager är ansluten till täckglas skapa brunnar i vilka vi kommer att placera de olika stammarna, vidhäftande dem med Concanavalin A till glaset. Det andra skiktet är en Y-formad mikrofluidanordning skapas med hjälp av metoden tejp 5. Efter placering av stammarna i brunnarna det andra skiktet snabbt linje och fäst till den första, skapar en kanal med flera brunnar som innehåller de olika stammarna. Denna sista enheten tillåter efter flera stammar i en kanal, där allastammar utsattes för samma förhållanden vid exakt samma tidpunkt. Hela konstruktionen och tillverkningsprocessen kan göras på bänken, med enkla medel, utan mjuk litografi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta papper presenterar vi en enkel bänk metod för att skapa en mikroflödessystem enhet som gör efter flera jäststammar samtidigt under dynamiska förhållanden. Efter flera stammar i en kanal ger ett pålitligt verktyg för att jämföra dynamik encelliga svar i flera stammar. En fördel med vår strategi är förmågan att tillverka anordningen med enkla tekniker utan behov av ett rent rum. I själva verket har vi också genomfört protokollet hoppa verksamheten plasmabehandling (i steg 2,9 och 3,6) och fick b…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YG stöds av en gemenskap från IDB. IN är en Alon karl och en fakultet kamrat av Edmond J. . Safra Centrum för bioinformatik vid Tel Avivs universitet . Denna forskning stöddes av ISF bidrag 1499/10.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | |
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2″ |
Referências
- Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).
- Paliwal, S. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, 46-51 (2007).
- Bennett, M. R., Hasty, J. Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells. Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters. Chips & Tips. , (2010).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).
