الجهد حساسة من تسجيل صبغ محاور عصبية، التشعبات والعمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الفردية في شرائح الدماغ
Summary
يوصف أسلوب التصوير لرصد التغيرات المحتملة للقرار غشاء شبه ميكرومتر المكانية وشبه ميلي ثانية واحدة والزمانية. هذه التقنية، على أساس الإثارة الليزر من الجهد حساسة الأصباغ، يسمح للإشارات القياسات في محاور عصبية والضمانات محوار والفروع الطرفية الجذعية، والعمود الفقري شجيري الفردية.
Abstract
فهم خصائص الفيزيائية الحيوية والتنظيم الوظيفي للخلايا العصبية، وكيف أنها واحدة من المعلومات العملية الأساسية لفهم كيفية عمل الدماغ. وتتمثل المهمة الرئيسية في أي خلية عصبية هو معالجة الإشارات الكهربائية، وعادة من مصادر متعددة. الخواص الكهربائية للعمليات العصبية معقدة للغاية، ودينامية، وأنه في حالة عامة، مستحيلا في غياب قياسات مفصلة. للحصول على مثل هذا القياس أحد أن، من الناحية المثالية، أن تكون قادرة على رصد، في مواقع متعددة، والأحداث دوين العتبة أثناء سفرهم من المواقع الأصلية على العمليات العصبية وsummate في مواقع معينة للتأثير على بدء العمل المحتملين. لم يتم تحقيق هذا الهدف في أي الخلايا العصبية بسبب القيود التقنية من القياسات التي تستخدم الأقطاب الكهربائية. للتغلب على هذا العيب، فمن المرغوب فيه جدا لاستكمال نهج التصحيح الكهربائي مع تقنيات التصوير التي تسمح recordin موازية واسعةع من جميع أجزاء من الخلايا العصبية. هنا، نحن تصف مثل هذه التقنية – تسجيل البصرية من العابرين غشاء المحتملة مع الأصباغ العضوية الجهد حساسة (V-M التصوير) – تتميز الفرعية ميلي ثانية واحدة والقرار شبه ميكرون. ويستند أسلوبنا في العمل الريادي على الجهد حساسة تحقيقات الجزيئية 2. وقد تم العديد من جوانب التكنولوجيا الأولي مواصلة تحسين على مدى عدة عقود 3، 5، 11. بالإضافة إلى ذلك، وثقت الأعمال السابقة سمتين أساسيتين للV-M التصوير. أولا، إشارات مضان تتناسب خطيا إلى غشاء المحتملة على نطاق والفسيولوجية كامل (-100 بالسيارات إلى بالسيارات +100 و 10 و 14 و 16). ثانيا، الخلايا العصبية التحميل مع صبغة حساسة الجهد المستخدمة هنا (JPW 3028) لا يكون لها آثار الدوائية للكشف. توسيع سجلت من ارتفاع أثناء التحميل هو عكسها تماما صبغ 4 و 7. بالإضافة إلى ذلك، تظهر الأدلة التجريبية أنه من الممكن الحصول علىعدد كبير (إلى مئات) من التسجيلات قبل أي تأثيرات السمية الضوئية للكشف 4 و 6 و 12 و 13. في الوقت الحاضر، ونحن الاستفادة من سطوع رائع والاستقرار ليزر مصدر الضوء في شبه الأمثل لتحقيق أقصى قدر الطول الموجي حساسية تقنية M-V التصوير. حساسية الحالي يسمح التسجيلات البصرية متعددة من موقع العابرين م V من جميع أجزاء من الخلايا العصبية، بما في ذلك محاور عصبية والضمانات محوار، شجيري الفروع الطرفية، والعمود الفقري شجيري الفردية. ويمكن تحليل المعلومات المكتسبة على التفاعلات إشارة كميا وكذلك تصور مباشرة في شكل فيلم.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه المقالة تسجيل صبغة حساسة للطريقة الجهد لرصد النشاط الكهربائي للخلايا العصبية الفردية مع ميكرومتر الفرعية والفرعية ميلي ثانية واحدة قرار الزمانية المكانية. تحسين الإثارة الليزر في شبه الأمثل الطول الموجي (بشأن حجم إشارة) حساسية تسجيل بمعامل ~ أكثر من 50 النه?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لدينا المتعاونين كنوت Holthoff، Konnerth آرثر وCanepari ماركو الذين شاركوا في التطوير الأولي لهذه التقنية وكذلك للوف M. ليزلي لتقديم التكرم الأصباغ. بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح منحة NSF-0817969 IOS، وNS068407 M136043 معهد كافلي وعلم الأعصاب في جامعة ييل.
Materials
| Name of the component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss AxioExaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392×1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
Referências
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Cohen, L. B., Salzberg, B. M. Optical measurement of membrane potential. Ann. Rev. Neurosci. 1, 171-182 (1978).
- Cohen, L. B., Canepari, M., Zecevic, D. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study. J. Physiol. 580, 463-484 (2007).
- Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D., Canepari, M., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones. J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).
- Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons. J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).
- Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy. Neuron. 55, 633-647 (2007).
- Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge. Biophysical J. 87, 631-639 (2004).
- Loew, L. M. Design and characterization of electrochromic membrane probes. J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).
- Loew, L., Canepari, M., Zecevic, D. Design and use of organic voltage sensitive dyes. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Palmer, L. M., Stuart, G. J. Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons. J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).
- Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study. J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential. J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).
- Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings. J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).
- Wu, J. -. Y., Cohen, L. B., Mason, W. T. Fast multisite optical measurement of membrane potential. A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. , 389-404 (1993).
- Yuste, R. . Dendritic Spines. , (2010).
