Spændingsfølsomme Dye Optagelse fra axoner, dendritter og dendrit udløberne af individuelle neuroner i hjernen Slices
Summary
En imaging teknik til overvågning af membran potentielle ændringer i sub-mikrometer rumlige og sub-millisekund tidsopløsning er beskrevet. Teknikken, baseret på laser excitation af spændingsfølsomme farvestoffer, tillader målinger af signaler i axoner og axon soeskende terminale dendritiske grene, og individuelle dendritiske spidser.
Abstract
Forståelse af de biofysiske egenskaber og funktionelle organisation af enkelte neuroner, og hvordan de behandle oplysninger er grundlæggende for at forstå, hvordan hjernen fungerer. Den primære funktion af en nervecelle er at behandle elektriske signaler, sædvanligvis fra flere kilder. Elektriske egenskaber neuronale processer er overordentlig kompleks, dynamisk, og, i det generelle tilfælde, umuligt at forudsige i fravær af detaljerede målinger. For at opnå en sådan måling ville man ideelt set gerne være i stand til at overvåge, på flere steder, subtærskel begivenhederne, som de rejser fra de steder, hvor oprindelsen på neuronale processer og summere på særlige steder at påvirke aktionspotentialets indvielse. Dette mål er ikke nået i nogen neuron grund af tekniske begrænsninger af målinger, der beskæftiger elektroder. At overvinde denne ulempe, er det meget ønskeligt at supplere patch-elektrode tilgang med billeddannelsesteknikker, der tillader omfattende parallelle recordings fra alle dele af et neuron. Her beskriver vi en sådan teknik – optisk registrering af membranpotentiale transienter med organiske spændingsfølsomme farvestoffer (V m-imaging) – kendetegnet ved sub-millisekund-og sub-mikrometer opløsning. Vores fremgangsmåde er baseret på pionerarbejde på spændingsfølsomme molekylære prober to. Mange aspekter af den oprindelige teknologi er løbende blevet forbedret gennem flere årtier 3, 5, 11. Derudover tidligere arbejde dokumenteres to væsentlige egenskaber ved V m-billeddannelse. For det første er fluorescenssignaler er lineært proportional med membranpotentialet i hele fysiologiske område (-100 mV til +100 mV, 10, 14, 16). For det andet er loading neuroner med den spændingsfølsomme farvestof anvendt her (JPW 3028) ingen påviselige farmakologiske virkninger. Den registrerede udvidelse af spyddet i løbet af farvestof loading er helt reversibel 4, 7. Derudover eksperimentelle beviser viser, at det er muligt at opnået betydeligt antal (op til hundreder) af optagelser før nogen påviselige fototoksiske effekter 4, 6, 12, 13. I øjeblikket tager vi fordel af den fremragende lysstyrke og stabiliteten af en laserlyskilde ved næsten optimal bølgelængde at maksimere følsomheden for V m-billeddannelsesteknik. Den aktuelle følsomhed tillader flere stedet optiske optagelser af V m transienter fra alle dele af en neuron, herunder axoner og axon soeskende terminale dendritiske grene, og de enkelte dendritiske Torner. Den indhentede information om signal interaktioner kan analyseres kvantitativt og visualiseres direkte i form af en film.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikel beskriver en spændingsfølsomme farvestof optagelse metode til overvågning elektriske aktivitet i individuelle neuroner med sub-mikrometer og sub-millisekund Spatiotemporal opløsning. Laser excitation ved næsten optimal bølgelængde (med hensyn til signal størrelse) forbedret følsomhed for registrering med en faktor på ~ 50 i forhold til tidligere fremgangsmåder. Den aktuelle følsomhed gør det muligt at overvåge elektriske signaler fra alle dele af de enkelte neuroner, herunder dendritter, axon…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for vores samarbejdspartnere Knut Holthoff, Arthur Konnerth og Marco Canepari som deltog i den indledende udvikling af denne teknik samt Leslie M. Loew for venligt at give farvestoffer. Støttet af NSF tilskud IOS-0817969, NIH tilskud NS068407 og M136043 og Kavli Institute for Neuroscience ved Yale University.
Materials
| Name of the component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss AxioExaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392×1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
Referências
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Cohen, L. B., Salzberg, B. M. Optical measurement of membrane potential. Ann. Rev. Neurosci. 1, 171-182 (1978).
- Cohen, L. B., Canepari, M., Zecevic, D. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study. J. Physiol. 580, 463-484 (2007).
- Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D., Canepari, M., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones. J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).
- Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons. J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).
- Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy. Neuron. 55, 633-647 (2007).
- Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge. Biophysical J. 87, 631-639 (2004).
- Loew, L. M. Design and characterization of electrochromic membrane probes. J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).
- Loew, L., Canepari, M., Zecevic, D. Design and use of organic voltage sensitive dyes. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Palmer, L. M., Stuart, G. J. Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons. J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).
- Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study. J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential. J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).
- Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings. J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).
- Wu, J. -. Y., Cohen, L. B., Mason, W. T. Fast multisite optical measurement of membrane potential. A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. , 389-404 (1993).
- Yuste, R. . Dendritic Spines. , (2010).
