Préparation d'<em> Drosophila</em> Les neurones centraux pour<em> In situ</em> Patch de serrage
Summary
Dans le patch situ enregistrements de serrage sont utilisés pour la caractérisation électrophysiologique des neurones dans les circuits intacts. Dans le modèle de la drosophile génétique patch-clamp est difficile, car le système nerveux central est petite et entourée d'une gaine robuste. Cet article décrit la procédure pour retirer les neurones gaine et propre pour la suite des enregistrements de patch-clamp.
Abstract
Temps de génération courts et faciles techniques génétiques faire la mouche du vinaigre Drosophila melanogaster un excellent modèle génétique dans la recherche en neurosciences fondamentales. Les canaux ioniques sont la base de tout comportement depuis qu'ils médiation excitabilité neuronale. Le canal d'ions première tension fermée cloné était la tension Drosophila canaux potassiques Shaker 1,2 fermée. La compréhension du rôle des canaux ioniques et excitabilité membranaire pour la fonction du système nerveux, il est utile de combiner puissants outils génétiques disponibles chez la drosophile in situ avec des enregistrements de patch-clamp. Pendant de nombreuses années ces enregistrements ont été entravés par la petite taille du SNC chez la drosophile. En outre, une gaine robuste en cellules gliales et de collagène constituent des obstacles pour l'accès pipette de patch pour les neurones centraux. La suppression de cette gaine est une condition préalable nécessaire pour les enregistrements de patch-clamp de toute neurone dans le SNC chez la drosophile adulte. Ces dernières années,les scientifiques ont été en mesure d'effectuer in situ des enregistrements de patch-clamp de neurones dans le cerveau adulte et 3,4 cordon nerveux ventral embryonnaire de 5,6, 7,8,9,10 larves et adultes Drosophila 11,12,13,14. Une étable giga-joint est la principale condition préalable à un bon patch et dépend de contact net de la pipette de patch avec la membrane de la cellule pour éviter les courants de fuite. Par conséquent, pour toute cellule in situ des enregistrements de patch-clamp de neurones de drosophile adulte doivent être soigneusement nettoyés. Dans la première étape, la gaine ganglionnaire doit être traitée par voie enzymatique et enlevées mécaniquement de rendre les cellules cibles accessible. Dans la seconde étape, la membrane de la cellule doit être polie de façon qu'aucune couche de matériau glie, le collagène ou d'autres peuvent perturber giga-joint formation. Cet article décrit comment préparer un neurone central identifié dans le cordon nerveux ventral chez la drosophile, le motoneurone vol 5 (MN5 15), pour tout c somatiqueenregistrements ell patch clamp. Identification et visibilité du neurone est obtenue par l'expression ciblée de la GFP dans MN5. Nous n'avons pas pour but d'expliquer la technique de patch-clamp lui-même.
Protocol
Discussion
Lors de la visualisation des cellules avec des protéines fluorescentes comme la GFP, il est important de ne pas trop exposer la préparation à trop de lumière. Il peut en résulter des dommages photo. Nous utilisons 100W HBO ampoules au mercure à arc court pour l'éclairage, et nous utilisons aussi de densité neutre (ND) de 0,8 (filtres ND Chroma 0,3 et 0,5). Pour être en mesure de juger de la qualité de la visibilité de nettoyage efficace est primordial. Par conséquent, les filtres ND peut être retiré po…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Agent/item | Company | Catalog number |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT |
| ND filter set (unmounted) | Chroma | 22000b series |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
Referências
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