בתיקון אתר הקלטות מהדקות משמשות לאפיון אלקטרו של הנוירונים במעגלים ללא פגע. בדרוזופילה הגנטית מודל התיקון Clamping קשה בגלל מערכת העצבים המרכזיים היא קטנה ומוקף בנדן איתן. מאמר זה מתאר את ההליך כדי להסיר את הנדן ונקי נוירונים להקלטות מהדקות תיקון לאחר מכן.
זמני דור קצרים וטכניקות גנטיות שטחיות להפוך זבוב דרוזופילה melanogaster מודל גנטי מצוין במחקר מדעי המוח יסודי. תעלות יונים הן בסיס לכל ההתנהגות שכן הם לתווך רגישות עצבית. הערוץ הראשון המתח מגודר היון המשובט היה ערוץ תסיסנית המתח המגודר אשלגן אכר 1,2. לקראת הבנת תפקידו של תעלות יונים ורגישות הממברנה לתפקוד מערכת עצבים כדאי לשלב כלים גנטיים רבים עצמה זמינות בדרוזופילה בהקלטות עם מהדק תיקון באתרו. במשך שנים רבות הקלטות כאלה כבר הקשו על ידי הגודל הקטן של מערכת העצבים המרכזיים תסיסנית. יתר על כן, נדן חזק עשוי גליה וקולגן היווה מכשולים לגישת פיפטה תיקון לנוירונים מרכזיים. הסרת מעטה זו היא תנאי הכרחי להקלטות מהדקות תיקון מכל תא עצב במערכת עצבים מרכזיים תסיסנית הבוגרת. בשנים האחרונותמדענים הצליחו לבצע בהקלטות מהדקות תיקון באתרו מתא העצב במוח הבוגר 3,4 וחוט עצב גחון של עוברי 5,6, זחל 7,8,9,10, ומבוגר תסיסנית 11,12,13,14. יציב גיגה חותם הוא התנאי העיקרי לתיקון טוב ותלוי במגע נקי של פיפטה התיקון עם קרום התא, כדי למנוע דליפת זרמים. לכן, לכל תא בהקלטות מהדקות תיקון באתרו מתאי עצב בוגרים תסיסנית יש לנקות ביסודיות. בשלב הראשון, את נדן ganglionic יש להתייחס enzymatically ומכאני הוסר כדי להפוך את תאי היעד נגישים. בשלב השני, קרום התא חייב להיות מלוטש כך שאין שכבה של גליה, קולגן או חומר אחר עלולה להפריע היווצרות גיגה חותם. מאמר זה מתאר כיצד להכין נוירון המרכזי זיהה את כבל תסיסנית גחון העצב, טיסת 5 motoneuron (MN5 15), לסומטי השלם גהקלטות מהדקות תיקון טו. זיהוי ונראות של נוירון מושג על ידי ביטוי ממוקד של ה-GFP בMN5. אנחנו לא שואפים להסביר את טכניקת מהדק התיקון עצמו.
כשמדמיינים את התאים עם חלבוני ניאון כמו GFP, חשוב לא מעל לחשוף את ההכנה ליותר מדי אור. זה עלול לגרום לניזק תמונה. אנו משתמשים בנורות 100W HBO קצרות קשת כספית לתאורה, ואנחנו משתמשים גם בצפיפות ניטראלית (ND) של 0.8 (מסנני ND Chroma 0.3 ו -0.5). כדי להיות מסוגל לשפוט על איכות הראות הטובה הנ?…
The authors have nothing to disclose.
Agent/item | Company | Catalog number |
Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 |
Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 |
Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 |
DiI | Invitrogen USA | D3899 |
Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT |
ND filter set (unmounted) | Chroma | 22000b series |
Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |