Utarbeidelse av<em> Drosophila</em> Central Neurons for<em> In situ</em> Patch Clamping
Summary
In situ patch clamp innspillinger brukes for elektrofysiologisk karakterisering av nevroner i intakt kretser. I Drosophila genetisk modell patch clamping er vanskelig fordi CNS er liten og omgitt av en robust slire. Denne artikkelen beskriver fremgangsmåten for å fjerne kappe og rene nevroner for senere patch clamp opptak.
Abstract
Kort generasjonstid og lettvinte genetiske teknikker gjør bananflue Drosophila melanogaster en utmerket genetisk modell i grunnleggende nevrovitenskap forskning. Ionekanaler er grunnlaget for all atferd siden de megle neuronal eksitabilitet. Den første spenningen gated ionekanal klonet var Drosophila spenning gated kaliumkanaler Shaker 1,2. Mot å forstå den rollen ionekanaler og membran eksitabilitet for nervesystemet funksjon er det nyttig å kombinere kraftige genetiske verktøy tilgjengelig i Drosophila med in situ patch clamp opptak. For mange år slike opptak har vært hemmet av den lille størrelsen på Drosophila CNS. Videre utgjorde en robust kappe laget av gliaceller og kollagen hindringer for patch pipette tilgang til sentrale nevroner. Fjerning av denne kappe er en nødvendig forutsetning for patch clamp opptak fra alle nervecelle i den voksne Drosophila CNS. I de senere åreneforskere har vært i stand til å gjennomføre in situ patch clamp opptak fra nerveceller i den voksne hjernen 3,4 og ventral nerve ledningen av 5,6 embryonale, larve 7,8,9,10, og voksen Drosophila 11,12,13,14. En stabil giga-tetning er den viktigste forutsetning for en god lapp, og avhenger ren kontakt av plasteret pipette med cellemembranen å unngå lekkasje strømninger. Derfor må for hele cellen in situ patch clamp opptak fra voksne Drosophila neurons rengjøres grundig. I det første trinn, har den Ganglionic hylse for å bli behandlet enzymatisk og mekanisk fjernet for å gjøre målet celler tilgjengelig. I det andre trinnet, har cellemembranen som skal poleres slik at ingen lag gliaceller, kollagen eller annet materiale kan forstyrre giga-forsegling formasjonen. Denne artikkelen beskriver hvordan du klargjør en identifisert sentral nervecelle i Drosophila ventrale nerve ledningen, flyturen motoneuron 5 (MN5 15), for somatisk hele cell patch clamp innspillinger. Identifisering og synlighet på den nervecellen oppnås ved målrettet uttrykk for GFP i MN5. Vi har ikke som mål å forklare patch clamp teknikken selv.
Protocol
Discussion
Når visualisere cellene med fluorescerende proteiner som GFP, er det viktig å ikke over-utsett preparatet som for mye lys. Dette kan resultere i bilde skade. Vi bruker 100W HBO korte arc kvikksølv pærer til belysning, og vi bruker også nøytral tetthet (ND) på 0,8 (Chroma ND filter 0.3 og 0.5). Å være i stand til å bedømme om kvaliteten av renhold god synlighet er avgjørende. Derfor kan ND filter tas ut for korte perioder av ca 20 s for flere ganger.
Ved søknad noen overtrykk, ce…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Agent/item | Company | Catalog number |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT |
| ND filter set (unmounted) | Chroma | 22000b series |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
Referências
- Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila. Science. 237, 749-753 (1987).
- Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila. Science. 237, 770-775 (1987).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (6), e248 (2007).
- Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O’Dowd, D. K. Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain. J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).
- Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
- Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current. J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).
- Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).
- Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons. J. Neurophysiol. , (2011).
- Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system. J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).
- Pulver, S. R., Griffith, L. C. Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics. Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS Biol. 4, e63 (2006).
- Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability. J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).
- Ryglewski, S., Duch, C. Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron. J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).
- Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons. J. Physiol. , (2011).
- Ikeda, K., Koenig, J. H. Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection. J. Vis. Exp. (52), e3080 (2011).
