Hazırlanması<em> Drosophila</emIçin> Orta Nöronlar<em> In situ</em> Patch Sıkma
Summary
In situ yama kelepçe kayıtları bozulmamış devresi nöronların elektrofizyolojik karakterizasyon için kullanılır. MSS küçük ve sağlam bir kılıf ile çevrili olduğundan Drosophila genetik model yama klemp ise zordur. Bu makale sonraki yama klemp kayıtları için kılıf ve temiz nöronlar kaldırmak için prosedürü açıklar.
Abstract
Kısa üretim süreleri ve basit genetik teknikler meyve sineği Drosophila melanogaster temel sinirbilim araştırması mükemmel bir genetik model olun. Onlar nöronal uyarılabilirliği arabuluculuk yana İyon kanalları tüm davranışların temelini oluşturur. Klonlanmış birinci voltaj kapılı iyon kanalı Drosophila voltaj bağımlı potasyum kanalı Shaker 1,2 idi. Sinir sistemi fonksiyonu için iyon kanalları ve membran eksitabilite rolünü anlamak doğru yerinde yama klemp kayıtları ile Drosophila güçlü genetik mevcut araçları birleştirmek için yararlıdır. Uzun yıllar boyunca bu kayıtlar Drosophila MSS küçük boyutu nedeniyle zorlanıyor. Ayrıca, glia ve kollajen yapılmış sağlam bir kılıf merkezi nöronlara yama pipet erişimlerinde engeller oluşturmuştur. Bu kılıf kaldırılmasını yetişkin Drosophila CNS herhangi bir nörondan yama kelepçe kayıt için gerekli bir ön koşuldur. Son yıllardabilim adamları yetişkin beyin 3,4 ve embriyonik 5,6, larva 7,8,9,10 ve yetişkin Drosophila 11,12,13,14 ventral sinir kablosunu nöronlardan yerinde yama klemp kayıtları yapmak mümkün olmuştur. İstikrarlı giga-mühür iyi bir yama için temel ön ve kaçak akımları önlemek için hücre zarı ile yama pipet temiz bir temas bağlıdır. Bu nedenle, erişkin Drosophila nöronların yerinde yama klemp kayıtları tüm hücre için iyice temizlenmesi gerekir. İlk adım olarak, ganglionik kılıf enzimatik olarak tedavi edilmesi için olan ve mekanik olarak hedef hücrelere erişilebilir hale getirmek için kaldırılmıştır. İkinci adımda, zar glia hücre, kolajen ya da diğer herhangi bir malzeme tabakası giga yapışma oluşumunun bozabilir, böylece cilalı gerekir. Bu makalede, somatik bütün c Drosophila ventral sinir kablosu, uçuş motonöron 5 (MN5 15), bir tespit merkez nöron nasıl hazırlanacağını anlatırell yama klemp kayıtları. Nöron tanımlanması ve görünürlük MN5 içinde GFP hedeflenen ifade ile elde edilir. Biz yama klemp tekniği kendisini açıklamak amacı yoktur.
Protocol
Discussion
GFP gibi floresan proteinleri ile hücrelerin görselleştirmek zaman, çok fazla ışığı hazırlık aşırı maruz bırakmayın önemlidir. Bu fotoğraf hasara neden olabilir. Biz aydınlatma için 100W HBO kısa ark cıva ampul kullanmak, ve biz de 0.8 (Chroma ND filtreler 0.3 ve 0.5) nötr yoğunluğu (ND) kullanın. Temizlik iyi bir görünürlük kalitesini yargılamak için edebilmek için önemlidir. Bu nedenle, ND filtre birden çok kez için yaklaşık 20 saniyelik kısa bir süre için kaldırılmış olabi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Agent/item | Company | Catalog number |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT |
| ND filter set (unmounted) | Chroma | 22000b series |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
Referências
- Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila. Science. 237, 749-753 (1987).
- Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila. Science. 237, 770-775 (1987).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (6), e248 (2007).
- Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O’Dowd, D. K. Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain. J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).
- Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
- Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current. J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).
- Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).
- Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons. J. Neurophysiol. , (2011).
- Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system. J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).
- Pulver, S. R., Griffith, L. C. Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics. Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS Biol. 4, e63 (2006).
- Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability. J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).
- Ryglewski, S., Duch, C. Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron. J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).
- Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons. J. Physiol. , (2011).
- Ikeda, K., Koenig, J. H. Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection. J. Vis. Exp. (52), e3080 (2011).
