Os tecidos músculo esquelético de engenharia a partir de células progenitoras mioblastos murinos e Aplicação da estimulação elétrica

Resumo

Tecido muscular de engenharia tem um grande potencial na medicina regenerativa, como modelo de doença e também como uma fonte alternativa para a carne. Aqui descreve-se a engenharia de uma construção de músculo, neste caso, a partir de células progenitoras, mioblastos de rato e a estimulação por pulsos eléctricos.

Resumo

Tecidos musculares engenharia pode ser utilizado para diversos fins, que incluem a produção de tecidos para utilização como um modelo de doença in vitro, por exemplo, para estudar as úlceras de pressão, para a medicina regenerativa e como uma alternativa a carne ^1. As primeiras construções relatados musculares 3D foram feitos há muitos anos e pioneiros no campo são Vandenburgh e colegas ^2,3. Avanços na engenharia de tecidos músculo não são apenas o resultado do ganho enorme no conhecimento de fatores bioquímicos, células-tronco e células progenitoras, mas estão em base particular em conhecimentos obtidos por pesquisadores que os fatores físicos desempenham papéis essenciais no controle do comportamento de células e tecidos de desenvolvimento. Estado-da-arte da engenharia muscular constrói atualmente consistem de construções de células-povoadas de hidrogel. No nosso laboratório que geralmente são constituídos por células mioblastos de murino progenitoras isoladas, a partir de murinos músculos dos membros posteriores ou de uma linha celular C2C12 de mioblastos de murino, mixado com uma mistura de colagénio / Matrigel e semeadas entre dois pontos de ancoragem, que imita os ligamentos musculares. Outras células podem ser considerados, bem como, por exemplo, linhas celulares alternativos, tais como os mioblastos L6 de rato neonatal musculares ^4, células progenitoras, células derivadas ⁵ derivadas de tecidos musculares adultas a partir de outras espécies, tais como ⁶ humana ou células pluripotentes estaminais ainda induzidas (células iPS) ⁷ . Contractilidade celular faz com que o alinhamento das células ao longo do eixo longitudinal da construção de ^8,9 e diferenciação das células progenitoras musculares após cerca de uma semana de cultura. Além disso, a aplicação de estimulação eléctrica pode melhorar o processo de diferenciação, em certa medida ^8. Devido ao seu tamanho limitado (8 x 2 x 0,5 mm) do tecido completo pode ser analisada utilizando microscopia confocal para monitorar a viabilidade por exemplo, diferenciação de células e de alinhamento. Dependendo da aplicação específica, os requisitos para a engineetecido muscular vermelho pode variar; por exemplo, utilização em medicina regenerativa requer o escalonamento do tamanho dos tecidos e a vascularização, enquanto para servir como uma tradução alternativa a outras espécies de carne é necessário.

Protocolo

1. Cultura de Células de mioblastos de murino progenitoras ou células C2C12

1. Isolar as células de acordo com o protocolo inicialmente publicado por Shefer e colegas ¹⁰ e posterior adaptada por Collins et al. ¹¹ e Boonen et al. ¹² e armazená-los em azoto líquido. Isto requer ratos, por exemplo, C57BL / 6. Os métodos alternativos são usadas em outros laboratórios, por exemplo, um método publicado em Journal of Experiments visualizadas por Li Y et al. ^13. Para os reagentes e equipamentos que são referidos na tabela da página 7 e 8. A partir do músculo de um rato irá geralm....

Resultados

O produto final será construções musculares, como indicado na Figura 3. O tamanho do tecido será de aproximadamente 8 mm de comprimento, 2 mm de largura e 0,5 mm de espessura. A estimulação eléctrica durante a diferenciação vai alterar a expressão das isoformas de cadeia pesada de miosina, mas não aumentar grandemente o processo de diferenciação, tal como induzida pelo meio de diferenciação 8, mas a estimulação eléctrica também pode ser aplicado no final do processo para verificar a funcionalidade do mú.......

Discussão

A engenharia de tecidos musculares tem um grande potencial para a utilização como um modelo de doença, para a triagem de drogas, em medicina regenerativa e para a produção de carne. No entanto, os requisitos para estas aplicações variar. Optou-se por trabalhar com uma combinação de colagénio e de matrigel, porque permite o alinhamento de colagénio e células porque as células progenitoras mioblastos requerem a presença de proteínas de membrana basal derivadas, tal como determinado em estudos anteriores 2D ^12. .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Matrigel factor de crescimento reduzido	Beckton Dickinson e
DMEM (glucose elevada) *	Gibco	42430
Avançado DMEM	Gibco	12491
Soro de cavalo	Gibco	65050-122
De soro fetal bovino	Greiner	758075
0,45 e 0,22 um filtro de seringa *	Whatmann (Schleicher e Scheull)	10462100
L-glutamina	Gibco	25030024
Penicilina / estreptomicina	Gibco	10378016
Anfotericina	Gibco	15290-018
Plástico para cultura	Greiner		Inclui frascos de cultura e pipetas
Extracto de embrião de galinha	United States Biological	C3999
Pipeta de Pasteur *	Hilgenberg		Pipetas Pasteur, com a constrição, com algodão L ponta, aberto: 230 mm de diâmetro com ponta de 0,9 - 1,1 mm
Pipeta de Pasteur *	Hilgenberg		Pipetas Pasteur, com a constrição, com algodão L ponta, aberto: 230 mm de diâmetro com ponta de 1,4 - 1,6 mm
Pipeta de Pasteur	VWR	612-1702
Colagenase tipo I*	Sigma	C0130-16
40 mM filtro célula *	BD Falcon	352340
Agulha de 19G
Elastômero	Dow Corning Corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210 #
Agente de cura	Dow Corning Corporation		Silastic MDX 4-4210 #
Velcro	Loja regular		Você pode comprar este em uma loja regular, usar apenas o lado macio
Colágeno tipo I, cauda de rato	BD Biosciences	3544236
C-Pace Pacer Cultura PE	Ionoptix
6 poços de placas de cultura de estimulação eléctrica	Beckton Dickinson-Falcon	BD Falcon # 353846
C-prato prato eletrodos cultura	Ionoptix
			* Necessária para o isolamento de células (ponto 1.1) # Juntos em um kit