Exame de seleção positiva e negativa Tímico por citometria de fluxo
Summary
Apresenta-se um método de citometria de fluxo com base para examinar o desenvolvimento das células T<em> In vivo</em> Usando camundongos geneticamente manipulados em um tipo selvagem ou de fundo do receptor de células T transgênico.
Abstract
Um sistema imunitário saudável requer que as células T respondem a antigénios estranhos, permanecendo tolerante para auto-antígenos. Rearranjo aleatório do receptor de células T (TCR) e loci α β gera um repertório de células T com grande diversidade de especificidade antigénica, tanto a auto-e estrangeiras. A selecção do repertório durante o desenvolvimento do timo é crítico para a geração segura e úteis células T. Defeitos de selecção tímica contribuir para o desenvolvimento de doenças auto-imunes e da imunodeficiência 1-4.
Progenitores de células T do timo entrar como duplamente negativos (DN) timócitos que não expressam CD4 ou CD8 co-receptores. Expressão da αβTCR e ambos os co-receptores ocorre na fase dupla (DP) positivo. Interacção do αβTCR com auto-péptido-MHC (pMHC) apresentado pelas células do timo determina o destino do timócito DP. Interações de alta afinidade levar a seleção negativa e eliminaçãoção de auto-reactivos timócitos. Baixa afinidade interacções resultam na selecção positiva e desenvolvimento de CD4 ou CD8 positivas únicas células (SP) T capazes de reconhecer antigénios estranhos apresentados pelo MHC próprio 5.
Selecção positiva pode ser estudada em ratinhos com um anticorpo policlonal repertório de TCR (tipo selvagem), observando a geração de células T maduras. No entanto, eles não são ideais para o estudo de selecção negativa, o que envolve a eliminação de pequenas populações específicas de antigénio. Muitos sistemas de modelos têm sido utilizados para estudar a selecção negativa, mas variam na sua capacidade para recapitular eventos fisiológicos 6. Por exemplo, a estimulação de vitro de timócitos falta o ambiente do timo, que está intimamente envolvido na selecção, ao passo que a administração de antigénio exógeno pode levar à supressão não específica de timócitos 7-9. Atualmente, as melhores ferramentas para estudar na seleção negativa vivo são ratos que expressam uma transgenic específica TCR para endógena antígeno próprio. No entanto, muitos modelos clássicos TCR transgénicos são caracterizados pela expressão prematura da cadeia TCRα transgénico no estádio de DN, resultando em prematuro de selecção negativa. O nosso laboratório desenvolveu o HY modelo CD4, no qual a transgénico HY TCRα condicionalmente está expresso na fase de DP, permitindo a selecção negativa para ocorrer durante a transição para DP SP como ocorre em ratinhos de tipo selvagem 10.
Aqui, nós descrevemos um protocolo de citometria de fluxo com base em examinar selecção positiva e negativa do timo no modelo do rato HY CD4. Enquanto a selecção negativa nos ratos CD4 HY é altamente fisiológico, estes métodos podem também ser aplicados a outros modelos de TCR transgénicas. Nós também irá apresentar as estratégias gerais para a análise de seleção positiva em um repertório policlonal aplicáveis a quaisquer camundongos geneticamente manipulados.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui apresentado pode ser usado para examinar a selecção positiva e negativa, em não-transgénicos TCR e ratinhos transgénicos TCR. Este protocolo descreve a coloração de antigenes de superfície. Para uma análise mais aprofundada dos mecanismos moleculares, é muitas vezes necessário efectuar a coloração intracelular. Nós usamos o BD Biosciences Kit Cytofix / Cytoperm para a maioria das proteínas intracelulares e da BD Biosciences kit de coloração Foxp3 para fatores de transcrição. Nós gera…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer Bing Zhang por sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (MOP-86595). TAB é um CIHR novo investigador e estudioso AHFMR. QH é apoiado por uma Bolsa de Pós-Graduação CIHR Canadá – Doutorado e um Studentship tempo inteiro AIHS. SAN é apoiado por uma Rainha Elizabeth II de Bolsas de Estudo de Pós-Graduação. AYWS é apoiado por uma Bolsa de Pós-Graduação NSERC – Doutorado.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HyClone Hank’s balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss – Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences – FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI – 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
Referências
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