Undersøkelse av thymus Positiv og negativ seleksjon av flowcytometri
Summary
Vi presenterer en flowcytometri-basert metode for å undersøke T celle utvikling<em> In vivo</em> Med genetisk manipulerte mus på en wildtype eller T-celle reseptor transgene bakgrunn.
Abstract
Et sunt immunsystem krever at T-cellene reagerer på utenlandske antigener mens resterende tolerant til selv-antigener. Tilfeldig omorganisering av T-celle reseptor (TCR) α og β loci genererer en T-celle repertoar med stort mangfold i antigen spesifisitet, både til seg selv og utenlandske. Utvalg av repertoaret under utvikling i thymus er kritisk for å generere sikre og nyttige T-celler. Defekter i thymisk utvalget bidrar til utvikling av autoimmune og immunsvikt sykdommer 1-4.
T celle progenitors angir thymus eksempel doble negative (DN) thymocytter som ikke uttrykker CD4 eller CD8 co-reseptorer. Ekspresjon av αβTCR og begge ko-reseptorer forekommer på den doble positive (DP) stadium. Samspillet av αβTCR med self-peptid-MHC (pMHC) presentert av thymus celler bestemmer skjebnen til DP thymocyte. Høy affinitet interaksjoner føre til negativ seleksjon og eliminertsjon av selvreaktive thymocytter. Lav affinitet interaksjoner resultat i positiv utvelgelse og utvikling av CD4 eller CD8 enkeltstående positive (SP) T-celler som er i stand til å gjenkjenne fremmede antigener presentert av self-MHC 5.
Positiv utvelgelse kan studeres i mus med en polyklonalt (wildtype) TCR repertoar ved å observere den generasjonen av modne T-celler. Men de er ikke ideelle for studiet av negativ seleksjon, som innebærer sletting av små antigenspesifikke populasjoner. Mange modell systemer har vært brukt til å studere negativ seleksjon men varierer i deres evne til å rekapitulere fysiologiske hendelser 6. For eksempel, i vitro stimulering av thymocytter mangler thymisk miljø som er nært involvert i valg, mens administrasjon av eksogent antigen kan føre til ikke-spesifikk sletting av thymocytter 7-9. Foreløpig de beste verktøyene for å studere in vivo negativ seleksjon er mus som uttrykker en transgENIC TCR spesifikk for endogen self-antigen. Imidlertid er mange klassiske TCR transgene modellene prematur ekspresjon av transgene TCRα kjeden ved DN stadiet, som resulterer i for tidlig negativ seleksjon. Vår lab har utviklet HY CD4 modell hvor den transgene HY TCRα er betinget uttrykkes på DP stadiet, slik negativ seleksjon å oppstå under DP til SP overgang som forekommer i wildtype mus 10.
Her beskriver vi en flowcytometri-basert protokoll for å undersøke thymic positiv og negativ seleksjon i HY CD4 mus modell. Mens negativ seleksjon i HY CD4 mus er svært fysiologisk, kan disse metodene også brukes til andre TCR transgene modeller. Vi vil også presentere generelle strategier for å analysere positiv utvelgelse i et polyklonalt repertoar som gjelder for alle genetisk manipulerte mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen presenteres her kan brukes til å undersøke positiv og negativ seleksjon i ikke-TCR transgene og TCR transgene mus. Denne protokollen beskriver farging av overflateantigener. For ytterligere analyse av molekylære mekanismer, er det ofte nødvendig å utføre intracellulær farging. Vi bruker BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit for de fleste intracellulære proteiner og BD Biosciences Foxp3 Staining Kit for transkripsjonsfaktorer. Vi vanligvis skaffe våre prøver umiddelbart etter farging. Imidlertid kan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Bing Zhang for hans teknisk assistanse. Dette arbeidet ble finansiert av kanadiske Institutes for Health Research (MOP-86595). TAB er en CIHR New Investigator og AHFMR Scholar. QH er støttet av en CIHR Canada Graduate Scholarship – Doctoral og en AIHS heltid studieplass. SAN er støttet av en dronning Elizabeth II Graduate Scholarship. AYWS støttes av en NSERC Postgraduate stipend – Doctoral.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HyClone Hank’s balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss – Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences – FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI – 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
Referências
- Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
- Liston, A. Gene dosage–limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
- Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
- Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
- Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
- Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
- Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
- Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
- Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
- Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
- Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
- Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
- Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
- Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
- Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
- Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
- Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
- Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
- Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
- Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
- Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).
