Tüm ex vivo ekimi ise, Gelişmekte Drosophila Brains
Summary
Bu makalede, bir taklit hangi bir yöntem açıklanır<em> In vivo</emBir> gelişme<em> Drosophila</emBir de> mantar vücut<em> Ex vivo</em> Kültür sistemi.
Abstract
Biz bütün Drosophila beyinleri ex vivo kültürlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu akut farmakolojik ve hücresel süreçlerin canlı görüntüleme izin vererek hücre biyolojisi ve merkezi beyin yapılarının gelişimini araştırmak için kronik genetik manipülasyonlar için bir kontrpuan olarak kullanılabilir. Tekniğinin bir örneği olarak, önce bizim laboratuar 1 ile çalışmak, daha önce tanınmayan Subselüler bölmesi Drosophila merkezi beynin akson aksonal ve somatodendritik bölmeler arasında yattığını göstermiştir. Aksonun ilk segmenti (AIS) 2 olarak adlandırılan bu bölmeye gelişimi, nöron spesifik siklin-bağımlı kinaz, Cdk5 bağlı genetik olarak gösterildi. Biz Cdk5-spesifik farmakolojik inhibitörleri roscovitine ve olomoucine 3 ile yabani tip Drosophila larva beyinleri ex vivo tedavi aktin örgütü akut değişikliklere neden olur, ve burada göstermekGenetik olarak Cdk5 aktivitesi eksikliği görülen mutantlarının değişiklikler taklit hücre yüzey proteini Fasciclin 2, lokalizasyonunu.
Ex vivo kültürü tekniği ikinci bir örneği, embriyonik mantar gövdesi (MB) larva yetişkine kadar metamorfoz sırasında gamma nöronların bağlantıların remodeling için sağlanmıştır. Mantar vücudu koku öğrenme ve sinek 4 bellek merkezidir ve bu gama nöronlar yetişkin innervasyon desen 5 kurmak için bir sonraki timepoint yeniden uzatması dalları daha sonra pupa gelişimi sırasında aksonal ve dendritik dalları budamak ve. MB Bu nöronların budama ecdysone reseptör B1 7 de hareket ederek, ecdysone, bir steroid hormon tarafından tetiklenen bir mekanizma ile, nörit dalları 6 lokal dejenerasyonu ile meydana gösterilmiştir ve bu aktivite bağımlı olmuştur ubikuitin-proteazom sistemi 6. Ex vivo kültür Bizim yöntemi b yapabilirsinize daha da gelişimsel yeniden mekanizmasını sorgulamak için kullanılır. Biz ex vivo kültür ortamında, MB gama nöronlar in vivo benzer bir zamanlaması ile gelişimsel budama işlemi değinmeyecek bulundu. Bu hücreler başkalaşım geri dönüşümsüz olarak işlemesi amacıyla doku explanting önce 1.5 saat puparium oluşumundan sonra beklemek, ancak, önemli idi; kültüründe çok az veya hiç metamorfoz yol pupariation başlangıcında hayvanların diseksiyonu. Böylece, uygun bir modifikasyonu ile ex vivo kültürü yaklaşımı ve merkezi beyin biyoloji açıdan kararlı şekilde dinamik incelemek için uygulanabilir.
Protocol
Discussion
Mutasyonlar ve transgenlerin ifadesi de dahil olmak üzere doku yapısı ve fonksiyonları, kronik genetik manipülasyonlar, tipik olarak ayırmak çok zor olabilir ve ani etkilerini ve geç dolaylı sonuçları karışımından oluşur. Farmakoloji ile genetik yöntemler tamamlayan bir fenotip arkasında zaman tabii sorgulama kolaylaştırabilir. Örneğin, bu Drosophila 10 spermatogenezisin sırasında farklı sitoskeletal bileşenlerin katkılarını kesme için güçlü bir yaklaşım olmu?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz el yazması üzerine tavsiye, yararlı tartışmalar ve yorumlar için laboratuarımızda tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Biz de özellikle biz yeniden deneylerde yetiştiricilik için beyinlerini parçalayıp önce 1.5 saat APF kadar beklemeniz mükemmel bir öneri için Marta Koch ve Bassem Hassan teşekkür etmek istiyorum. Biz de onların konfokal mikroskop kullanımı için NHGRI görüntüleme tesisi teşekkür ederim. Bu çalışma NINDS İntramural Araştırma Programı, Ulusal Sağlık Enstitüsü (Z01 NS003106) Temel Nörobilim Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Final Concentration |
| Schneider’s Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Scientific | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
