Vesículas unilamelares grandes (LUVs) bioquimicamente definidas são um sistema modelo conveniente para analisar as interações da família BCL-2, com implicações diretas na melhor compreensão da via mitocondrial da apoptose. Apresenta-se um método para produção de LUVs, juntamente com combinações padrão de proteínas da família BCL-2 e controles para examinar a permeabilização de LUVs.
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Artigo de método
Examinando BCL-2 Função Família com grandes vesículas unilamelares
Neste artigo
Resumo
Resumo
A família BCL-2 (linfoma de células B CLL/linfoma) é composta por aproximadamente vinte proteínas que colaboram para manter a sobrevivência celular ou iniciar a apoptose1. Após estresse celular (por exemplo, dano ao DNA), os efetores pró-apoptóticos da família BCL-2, BAK (mortal antagonista de BCL-2 1) e/ou BAX (proteína associada a BCL-2 X), são ativados e comprometem a integridade da membrana mitocondrial externa (MME), por meio do processo denominado permeabilização da membrana mitocondrial externa (MME)1. Após a ocorrência da MME, proteínas pró-apoptóticas (por exemplo, citocromo c) ganham acesso ao citoplasma, promovem a ativação de caspases e a apoptose ocorre rapidamente2.
Para que BAK/BAX induzam a MOMP, eles requerem interações transitórias com membros de um outro subconjunto pró-apoptótico da família BCL-2, as proteínas somente do domínio de homologia BCL-2 (BH3), como BID (agonista do domínio interativo BH3)3-6. As proteínas da família BCL-2 antiapoptóticas (por exemplo, gene relacionado à BCL-2, isoforma longa, BCL-xL; leucemia de células mieloides 1, MCL-1) regulam a sobrevivência celular controlando rigorosamente as interações entre BAK/BAX e as proteínas somente BH3 capazes de induzir diretamente a ativação de BAK/BAX7,8. Além disso, a disponibilidade das proteínas BCL-2 antiapoptóticas também é determinada pelas proteínas sensibilizadoras/desrepressoras somente BH3, como BAD (antagonista da morte celular BCL-2) ou PUMA (modulador da apoptose regulado por p53), que se ligam e inibem membros antiapoptóticos7,9. Como a maior parte do repertório de BCL-2 antiapoptótica está localizado na MMO, a decisão celular entre manter a sobrevivência ou induzir a MOMP é determinada por múltiplas interações da família BCL-2 nesta membrana.
Vesículas unilamelares grandes (VULCs) são um modelo bioquímico para explorar as relações entre as interações da família BCL-2 e a permeabilização da membrana10. As LUVs são compostas por lipídios definidos que são montados em proporções identificadas em estudos de composição lipídica a partir de mitocôndrias de Xenopus extraídas com solvente (46,5% fosfatidilcolina, 28,5% fosfatidiletanolamina, 9% fosfatidilinositol, 9% fosfatidilserina e 7% cardiolipina)10. Este é um sistema modelo conveniente para explorar diretamente a função da família BCL-2, pois os componentes proteicos e lipídicos são completamente definidos e passíveis de manipulação, o que nem sempre ocorre com mitocôndrias primárias. Embora a cardiolipina normalmente não esteja presente em concentrações tão elevadas em toda a membrana mitocondrial externa (OMM), este modelo imita fielmente a OMM para promover a função da família BCL-2. Além disso, uma modificação mais recente do protocolo descrito permite análises cinéticas de interações proteicas e medidas em tempo real da permeabilização da membrana, baseadas em LUVs contendo um corante policatiônico (ANTS: 8-aminonaftaleno-1,3,6-trissulfônico) e um quenchador catiônico (DPX: p-xileno-bis-piridínio brometo)11À medida que as LUVs se tornam permeáveis, ANTS e DPX difundem-se separadamente, e um aumento na fluorescência é detectado. Aqui, são descritas combinações comumente utilizadas de proteínas recombinantes da família BCL-2 e controles empregando LUVs contendo ANTS/DPX.
Protocolo
1. Combine lipídios e crie um filme lipídico
- Trabalhando em uma capela com iluminação mínima, lipídios solubilizados em clorofórmio são combinados em um frasco âmbar de vidro de 1,5 ml utilizando uma seringa de vidro estanque ao gás Hamilton previamente lavada com clorofórmio. Essa combinação produzirá aproximadamente 4 mg de lipídio (Figura 1A).
- Cardiolipina 10 mg/ml (CL) - 63 μl
- Fosfatidilcolina 10 mg/ml (PC) - 84 μl
- Fosfatidiletanolamina 10 mg/ml (PE) - 125 μl
- Fosfatidilinositol 10 mg/ml (PI) - 59,5 μl
- Fosfatidilserina 10 mg/ml (PS) - 65 μl
- Para remover o c....
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Discussão
O método descrito para gerar LUVs permite uma forma rápida e eficiente de testar a função de várias proteínas da família BCL-2, peptídeos e reagentes relacionados em um ambiente de membrana definido bioquimicamente, semelhante à MMO. Se forem utilizados valores finais para determinar a permeabilização de LUVs, várias placas podem ser montadas para analisar centenas de condições em um único dia. Observamos que os reagentes limitantes nestes ensaios costumam ser a qualidade e a quantidade das proteínas recombinantes; porta.......
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Divulgações
Nenhum conflito de interesses declarado.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a todos os membros do Laboratório Chipuk pelo companheirismo e apoio. Além disso, gostaríamos de expressar nossa gratidão a Tomomi Kuwana e Donald Newmeyer pelo desenvolvimento da base experimental para este trabalho. Este trabalho foi financiado por: NIH CA157740 (para J.E.C.) e um projeto-piloto da NIH P20AA017067 (para J.E.C.). Este trabalho também foi parcialmente apoiado por uma Bolsa de Pesquisa 5-FY11-74 da Fundação March of Dimes (para J.E.C.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosph–thanolamine "PE" | Avanti | 850725C | |
| L-α-Fosfatidilcolina (Ovo, Galinha) "PC" | Avanti | 840051C | |
| L-α-Fosfatidilinositol (Fígado, Bovino) "PI" | Avanti | 840042C | |
| L-α-Fosfatidilserina (Cérebro, Suíno) "PS" | Avanti | 8400320 | |
| Cardiolipina (Coração, Bovino - Sal de Sódio) "CL" | Avanti | 840012C | |
| Conjunto mini-extrusor | Avanti | 610023 | |
| Membrana de PC 0,2 mM | Avanti | 610006 | |
| Placa Costar preta de 96 poços | Fisher Scientific | 07-200-590 | |
| BID clivada por caspase-8 humana | R&D Systems | 882-B8-050 | |
| BCL-xL humano (sem o extremo C) | R&D Systems | 894-BX-050 | |
| Peptídeos dos domínios BH3 de BID/PUMA | Anaspec | 61711/62404 | |
| Leitor microplaquetas multifuncional Synergy H1 | BioTek | None |
Referências
- Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).
- Green, D. R. Apoptotic pathways: ten minutes to dead. Cell. 121, 671-674 (2005).
- Gavathiotis, E.
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Reimpressões e permissões
