病におけるクロマチンプロテオームの定量的解析
1Department of Anesthesiology,David Geffen School of Medicine at UCLA, 2Department of Medicine,David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Department of Physiology,David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Internal Medicine,Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah
Summary
質量分析法の進歩により、組織の宿主におけるタンパク質発現および変更のハイスループット解析を可能にした。細胞下分画と疾患モデルと組み合わせることで、定量的質量分析法とバイオインフォマティクス、生物学的システムに新しい特性を明らかにすることができます。本明細書に記載される方法は、心臓病の設定でクロマチン関連タンパク質を解析し、他に容易に適用可能である<em生体内で></em>ヒト疾患のモデル。
Abstract
核の中でその機能が最も密接な遺伝子調節にリンクされているプロテオームを常駐しています。哺乳類成体心筋細胞核DNAの大部分はヘテロクロマチン状態、相間の永続的な状態にある成人核をレンダリングする心筋細胞の非分裂性質1、二核細胞の割合が高いのために独特である。2転写調節は、開発時とこの病気は、このオルガンでよく研究されて3月5日が、何が比較的未開拓のままでは、DNAのパッケージングおよび発現に関与する核タンパク質が果たす役割であり、どのように病気の経過中に生じる転写プログラムにおけるこれらのタンパク質制御の変更。開発した6世界では、心臓病は、男性と女性両方のため死亡原因の第1位です。核タンパク質は、この病気の進行を調節するために協力する方法について7 Insightは、現在の治療oを進めるために重要であるptions。
質量分析法は、それが病気とどのようにこれらのタンパク質の量が変化するため、核プロテオームと相対定量の公平な注釈を可能として、これらの質問に対処するための理想的なツールです。最近まで哺乳類の核タンパク質複合体、8月13日にいくつかのプロテオミクス研究がなされているものの14は、心臓核プロテオームを調べるだけで一つの研究がなされており、それはむしろ核サブコンパートメントのレベルでプロテオームを探索するのではなく、核全体を考慮15大部分では、仕事のこの不足は、心臓核を単離することが困難なためである。心臓核が筋収縮を変化させるが、その全体的な形状図16はさらに、心筋細胞は17巻までに40％ミトコンドリアである限り、彼らは小胞体からの複数の拡張子を介して接続されている硬質かつ緻密なアクチン-ミオシン装置内で発生するnecessita他の細胞小器官は別に核の濃縮をTES。ここでは、心臓の核濃縮と生物学的に関連したコンパートメントにさらに分別するためのプロトコルを記述します。さらに、代謝標識が不可能な様々な動物モデルや器官系を用いたin vivo実験で影響を受けやすいこれらの画-技法のラベルフリー定量的質量分析解離の詳細メソッド。
Protocol
実験のワークフローの主要7の手順を実行します（ 図1）が含まれています。質量分析計で実行されるサンプルを含む任意の仕事のために、実験者は白衣、手袋、ヘアネットを着用し、粉塵やケラチンの個人的な脱落による汚染を避けるために世話をする必要があります。 1。ハート均質化と核分離マウスの心臓は均質化され、無傷の核ペ?…
Representative Results
図4は、相対定量のこの形式の有用性を強調しています。左側のパネルに表示されているタンパク質HMGB1（データベース検索を経由して識別される）に属するものとして指定されている個々のモノペプチドのピークは（異なるマウスから重ねて）である。各ピークは、本質的に与えられたペプチドの抽出イオンクロマトグラフは、異なるマウスから来ている。 3生物学的なグルー?…
Discussion
核の単離のための2つの主な方法は、以前に検討されている：27 1は、水性スクロース/塩溶液中で組織を均質化する非水系溶媒に凍結乾燥組織を均質化するベーレンス技術そして第二に、我々はここで使用しているかに変更、です続く差動または密度勾配遠心分離による。
組織サンプルの酸抽出による核の亜分画は、ヒストンを分析するためにある本来の目的で196…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VondriskaラボはNIHやUCLAのLaubisch基金の国立心肺血液研究所からの助成金によってサポートされています。 EMは、UCLAの生理学のジェニファーS. Buchwaldの大学院奨学金の受取人である; HCは、アメリカ心臓協会の事前博士フェローシップの受賞者です、MPは、NIHルースキルシュシュタインポスドクフェローシップの受信者であり、SFはの受信者であるNIHのK99賞。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | |
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | |
| Oriole | BioRad | 161-0496 |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
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Citar este artigo
Monte, E., Chen, H., Kolmakova, M., Parvatiyar, M., Vondriska, T. M., Franklin, S. Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease. J. Vis. Exp. (70), e4294, doi:10.3791/4294 (2012).