التحليل الكمي من Proteomes الكروماتين في الأمراض
Summary
وقد سمح التقدم في مطياف الكتلة لتحليل إنتاجية عالية البروتين التعبير والتعديل على مجموعة من الأنسجة. جنبا إلى جنب مع تجزئة التحت خلوية ونماذج المرض والكتلة الطيفي الكمي والمعلوماتية الحيوية يمكن أن تكشف عن خصائص جديدة في النظم البيولوجية. الطريقة الموضحة هنا يحلل لونين البروتينات المرتبطة في تحديد أمراض القلب وينطبق بسهولة إلى أخرى<em> في الجسم الحي</em> نماذج من الأمراض التي تصيب البشر.
Abstract
في النواة الموجودة في proteomes التي هي الأكثر ارتباطا وثيقا وظائف مرتبطة مع تنظيم الجينات. الكبار نوى cardiomyocyte الثدييات هي فريدة من نوعها نظرا لنسبة عالية من الخلايا binucleated، 1 heterochromatic الدولة في الغالب من الحمض النووي، وطبيعة تقسيم غير من cardiomyocyte مما يجعل نوى الكبار في حالة دائمة من الطور البيني .. 2 تنظيم الترانسكربتي خلال تطوير و وقد المرض مدروسة في هذا الجهاز، 3-5 ولكن ما زال غير مستكشفة نسبيا هو الدور الذي تقوم به البروتينات النووية المسؤولة عن التعبئة والتغليف DNA والتعبير، وكيف يمكن لهذه البروتينات السيطرة تغييرات في برامج النسخ التي تحدث أثناء المرض. 6 في تطوير العالم، وأمراض القلب هي السبب الأول للوفيات لكل من الرجال والنساء .. 7 انسايت حول كيفية البروتينات النووية لتنظيم التعاون تطور هذا المرض أمر بالغ الأهمية للنهوض الحالية س العلاجيارات.
قياس الطيف الكتلي هو الأداة المثالية لمعالجة هذه الأسئلة لأنها تسمح للتعليق توضيحي متحيز للبروتيوم الكمي النووية والنسبية لكيفية وفرة من هذه البروتينات مع التغيرات المرض. في حين كانت هناك دراسات عدة عن البروتين البروتين الثدييات المجمعات النووية، 8-13 وحتى وقت قريب كان هناك 14 دراسة واحدة فقط فحص القلب النووي بروتيوم، وأنها تعتبر نواة بأكملها، بدلا من استكشاف بروتيوم على مستوى حجرات فرعية النووية 15 في جزء كبير منه، هذا النقص في العمل ويرجع ذلك إلى صعوبة عزل نواة القلب. نوى القلب تحدث داخل جهاز أكتين الميوسين-جامدة وكثيفة لأنها التي ترتبط عبر ملحقات متعددة من الشبكة الإندوبلازمية، إلى الحد الذي يغير شكل خلية عضلية تقلص بشكل عام 16 بالإضافة إلى ذلك، cardiomyocytes هي 40٪ من حيث الحجم الميتوكوندريا 17 الذي necessitaقسم التدريب والامتحانات إثراء النواة وبصرف النظر عن العضيات الأخرى. نحن هنا وصف بروتوكول للتخصيب النووي وتجزئة القلب الى مزيد من حجرات بيولوجيا ذات الصلة. وعلاوة على ذلك، فإننا طرق بالتفصيل لتسمية خالية تشريح الشامل الكمي الطيفي لهذه الكسور تقنيات قابلة للتجريب في الجسم الحي في النماذج الحيوانية المختلفة وأجهزة الجسم حيث وضع العلامات الأيضية ليست مجدية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استعرضت طريقتين رئيسيتين لعزل النووية سابقا: 27 واحد هو أسلوب بيرنس من المجانسة الأنسجة مجفف بالتجميد في المذيبات غير المائية، والثاني، وهو التعديل الذي نستخدمه هنا، من التجانس في الأنسجة السكروز المائي / محلول الملح يتبع بواسطة الطرد المركزي أو الفرق الكث…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم اعتماد مختبر Vondriska من المنح المقدمة من معهد القلب والرئة والدم الوطني من المعاهد الوطنية للصحة والمؤسسة Laubisch في جامعة كاليفورنيا. EM هو المستفيد من جنيفر S. زمالة دراسات عليا في الفسيولوجيا بوخفالد في جامعة كاليفورنيا؛ HC وهو حاصل على زمالة القلب الأمريكية ما قبل الدكتوراه جمعية؛ MP وهو حاصل على زمالة روث NIH ما بعد الدكتوراه كيرشتاين، وSF وهو حاصل على وK99 NIH جائزة.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | |
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | |
| Oriole | BioRad | 161-0496 |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
References
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Rumyantsev, P. P. Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration. Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).
- Olson, E. N., Schneider, M. D. Sizing up the heart: development redux in disease. Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).
- Molkentin, J. D., Dorn, G. W. Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).
- Fishman, M. C., Chien, K. R. Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Development. 124, 2099-2117 (1997).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R., Gerace, L. Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics. Science. 301, 1380-1382 (2003).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Malik, P., et al. Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope. Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).
- Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).
- Chu, D. S., et al. Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors. Nature. 443, 101-105 (2006).
- Uchiyama, S., et al. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
- Kislinger, T., et al. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Moore, D. H., Ruska, H. Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells. J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).
- Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage. J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).
- Paulsson, A. K., et al. Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy. Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).
- Franklin, S., et al. Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth. Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Gramolini, A. O., et al. Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses. Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).
- Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178 (2009).
- Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics. Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).
- Kamleh, A., et al. Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).
- Searle, B. C. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).
- Murray, K. The Basic Proteins of Cell Nuclei. Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).
- Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus. Biochem. J. 77, 631-636 (1960).
- Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications. Nucleic Acids Res. 37, e81 (2009).
- Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues. J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).
- Gronow, M., Griffiths, G. Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei. FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).
- Mischke, B. G., Ward, O. G. Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba. Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).
- Andersen, J. S., et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).
- Zhao, Y., Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques. Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).
- Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS. Proteomics. 10, 671-686 (2010).
- Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns. Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Mol. Cell Proteomics. , (2012).
- Wu, C., et al. A protease for ‘middle-down’ proteomics. Nat. Methods. , (2012).
- Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480, 254-258 (2011).
