Análise quantitativa de proteomas cromatina na Doença

Resumo

Avanços na espectrometria de massa permitiu a análise de alto rendimento de expressão da proteína e da modificação de uma série de tecidos. Combinada com fraccionamento subcelular e modelos de doença, a massa espectrometria quantitativa e bioinformática pode revelar novas propriedades nos sistemas biológicos. O método aqui descrito analisa cromatina proteínas associadas na definição de doença cardíaca e é prontamente aplicável a outras In vivo Modelo de doenças humanas.

Resumo

No núcleo residem os proteomas cujas funções são mais intimamente ligada com a regulação dos genes. Núcleos de cardiomiócitos de mamíferos adultos são únicos, devido à alta porcentagem de células binucleadas, ^um estado predominantemente heterocromático do DNA, ea natureza não-divisão da cardiomiócitos que torna núcleos de adultos em um permanente estado de interfase. Regulação transcricional ² durante o desenvolvimento e doença têm sido bem estudado neste órgão, ^3-5 mas que continua a ser relativamente pouco explorado o papel desempenhado pelas proteínas nucleares responsáveis ​​pela embalagem de ADN e de expressão, e como estas proteínas controlar alterações em programas de transcrição que ocorrem durante a doença. ⁶ No desenvolvido mundo, a doença cardíaca é a causa número um de morte para homens e mulheres. ⁷ dicas sobre como proteínas nucleares cooperar para regular a progressão da doença é fundamental para o avanço do atual tratamento oPÇÕES.

Espectrometria de massa é a ferramenta ideal para abordar estas questões, pois permite uma anotação imparcial da quantificação nuclear proteoma e relativo como a abundância destas proteínas mudanças com a doença. Embora tenha havido vários estudos proteômicos para mamíferos complexos proteicos nucleares, ^8-13, até recentemente, ^14, tem havido apenas um estudo examinando o proteoma nuclear cardíaco, e é considerado todo o núcleo, em vez de explorar o proteoma ao nível dos sub compartimentos nucleares . ¹⁵ Em grande parte, esta falta de trabalho é devido à dificuldade de isolar núcleos cardíaca. Núcleos cardíaco ocorrem dentro de uma superfície rígida e densa aparelho actina-miosina ao qual estão ligados através de várias extensões do retículo endoplasmático, na medida em que se altera a contração do miócito sua forma geral. ¹⁶ Além disso, os cardiomiócitos são de 40%, em volume, ¹⁷ mitocôndrias que necessitates enriquecimento do núcleo além dos outros organelos. Aqui nós descrevemos um protocolo de enriquecimento nuclear cardíaca e fraccionamento em compartimentos biologicamente relevantes. Além disso, os métodos detalhados para a etiqueta livre de dissecção de massa espectrométrica quantitativa destas fracções-técnicas passíveis de experimentação in vivo em vários modelos animais e sistemas de órgãos, onde marcação metabólica não é viável.

Protocolo

O fluxo de trabalho experimental contém sete etapas principais (Figura 1). Para qualquer trabalho envolvendo amostras que serão executados no espectrômetro de massa, o pesquisador deve vestir um jaleco, luvas e rede de cabelo e tomar cuidado para evitar a contaminação de poeira e derramamento pessoal de queratina.

1. Homogeneização coração e Isolamento Nuclear

Corações de rato são homogeneizados e um núcleo intacto pellet é isolado (Figura 2).

1. Sacrificar rato adulto, extirpar o coração, lavar em PBS gelado, e homogeneizar em gelo em Dounce de vidro (nós preferimos o....

Resultados

A Figura 4 evidencia a utilidade desta forma de quantificação relativa. Mostrado no painel da esquerda são os picos de peptídeos individuais monoisotópico (sobreposta de camundongos diferentes), que tenham sido designadas como pertencentes ao HMGB1 proteína (identificados através de pesquisa de banco de dados). Cada pico, essencialmente, um cromatógrafo de iões extraídos para o dado péptido, vem de um rato diferente. Os grupos representam três diferentes estados fisiológicos: hipertrofia, basal cardíaca.......

Discussão

Dois principais métodos para o isolamento nuclear foram revistas anteriormente: ²⁷ um é a técnica de homogeneização Behrens tecido liofilizado num solvente não-aquoso e a segunda, uma modificação do que se usar aqui, de homogeneização de tecidos em uma solução aquosa de sacarose / solução salina seguido pelo diferencial ou gradiente de densidade de centrifugação.

Subfractionation dos núcleos por extracção em meio ácido, em amostras de tecidos é uma ferramenta importante para o est.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Dulbeco Modified Eagle Médium	Invitrogen	11965
Protease pellet	Roche	04 693 159 001
100 filtro mM	BD Falcon	352360
Ultracut ultramicrótomo	Reichert
100CX Eletrônica de Transmissão Microscópio	JEOL EUA, Inc.
Papa-figos	BioRad	161-0496
Anticorpo H2A histona	Santa Cruz	sc-8648
Nucleoporin anticorpo p62	BD Biosciences	610498
Adenina nucleoanticorpo transportador maré	Santa Cruz	sc-9299
BiP anticorpo	Santa Cruz	sc-1050
Anticorpo tubulina	Sigma	T1568
Anticorpo histona H3	Abcam	ab1791
Anticorpo fibrilarina	Sinalização celular	C12C3
SNRP70 anticorpo	Abcam	ab51266
E2F-1 anticorpo	Thermo Fisher	MS-879
Anticorpo Retinoblastoma	BD Biosciences	554136
Fator-1 induzível hipóxia anticorpo	Novus Biologicals	NB100-469
Ensaio de proteína BCA	Thermo Scientific	23227
Inverter coluna de fase	Obj Novativa	PFC7515-B14-10
Navegador BioWorks	Thermo Scientific