Opdræt og Injektion af<em> Manduca sexta</em> Larver at vurdere bakteriel virulens
Summary
Den her beskrevne metode anvender direkte injektion af insektspecifikke bakterier i hemocoel af<em> Manduca sexta</em> Insektlarver.<em> M. sexta</em> Er et kommercielt tilgængeligt og velundersøgte insekt. Således er denne fremgangsmåde er en enkel tilgang til analyse host-bakterielle interaktioner med udgangspunkt i en eller begge parter.
Abstract
Manduca sexta, almindeligvis kendt som tobak hornworm, betragtes som en betydelig landbrugs skadedyr, fodring på planter af natskyggefamilien, herunder tobak og tomat. Modtageligheden af M. sexta-larver til en række insektspecifikke bakteriearter 1-5, samt mangfoldighed af oplysninger om insekt immunsystem 6-8, og den verserende genomsekvens 9 gør det til en god model organisme til anvendelse ved undersøgelse host-mikrobe interaktioner under patogenese. Desuden M. sexta-larver er relativt store og nemme at manipulere og opretholde i laboratoriet i forhold til andre modtagelige insekter. Deres store størrelse også muliggør en effektiv væv / hæmolymfe ekstraktion til analyse af værtens respons på infektion.
Fremgangsmåden præsenteres her beskriver direkte injektion af bakterier ind i hemocoel (blod hulrum) i M. sexta-larver. Denne fremgangsmådekan anvendes til at analysere og sammenligne de virulente egenskaber ved forskellige bakterielle arter, stammer, eller mutanter ved blot at overvåge den tid, at insektet dør efter injektion. Denne metode blev udviklet til at studere patogeniciteten af Xenorhabdus og Photorhabdus species, som typisk vedrører med nematode vektorer som et middel til at få adgang til det insekt. Insektspecifikke nematoder typisk inficere larver via naturlige fordøjelsesforstyrrelser eller respiratoriske åbninger, og frigive deres symbiotiske bakterielle indhold i insekt hemolymph (blod) kort efter 10. Injektionen her beskrevne fremgangsmåde omgår behovet for et nematode vektor, således frakobling af virkningerne af bakterier og nematode på insektet. Denne fremgangsmåde tillader nøjagtig tælling af infektiøst materiale (celler eller protein) i inokulum, hvilket ikke er muligt med andre eksisterende metoder til analyse entomopathogenesis, herunder nicking 11 og oral toksicitet assays 12 <em>. Også oral toksicitet assays fat virulens udskilte giftstoffer indført i fordøjelsessystemet af larver, mens den direkte indsprøjtning metode omhandler virulens helcelle-podestoffer.
Anvendeligheden af den direkte indsprøjtning som beskrevet her er at analysere bakteriel patogenese ved at overvåge insekt dødelighed. Imidlertid kan denne fremgangsmåde let udvides til anvendelse ved undersøgelse af virkningerne af infektion på M. sexta immunsystem. Insektet reagerer på infektion via både humorale og cellulære responser. Den humorale reaktion indbefatter anerkendelse af bakteriel-associerede mønstre og efterfølgende produktion af forskellige antimikrobielle peptider 7, ekspressionen af gener kodende for disse peptider kan overvåges efter direkte infektion via RNA-ekstraktion og kvantitativ PCR 13. Den cellulære respons på infektion involverer rodknolddannelse, indkapsling, og fagocytose af infektiøse agenser fra hæmocytter 6 </sup>. For at analysere disse svar, kan injiceres insekter blive dissekeret og visualiseres ved mikroskopi 13, 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den direkte injektion af M. sexta-larver med insektspecifikke bakterier, som beskrevet her, tjener som et enkelt og effektivt middel til at analysere bakteriel virulens. Fremgangsmåden er også meget fleksibel til forskellige forsøgspersoner og / eller betingelser. Bakterier kan fremstilles på forskellige måder før injektion. I tilfælde af X. nematophila, vildtypeceller dyrket i næringsrige Luria-Bertani (LB) medium til mid-log fase, er typisk de mest virulente, dræbe de fleste eller alle insek…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke tidligere medlemmer af Goodrich-Blair lab: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard, og Youngjin Park for deres bidrag til udviklingen af denne protokol. Dette arbejde blev finansieret af National Science Foundation tilskud IOS-0950873 og National Institutes of Health NRSA stipendium FAI084441Z.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375″ length, point style 2 |
Referências
- Bintrim, S. B., Ensign, J. C. Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes. J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).
- Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta. Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).
- Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens. Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).
- Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera). Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).
- Forst, S. A., Tabatabai, N. Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus. Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).
- Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta. Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).
- Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).
- Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus. Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- D’Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection. J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).
- Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).
- Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity. Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).
- Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).
- Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila. Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).
- Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects. Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).
- Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus. J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).
- Kavanagh, K., Reeves, E. P. Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).
