Assay רובד לnorovirus Murine
Summary
כאן אנו מתארים שיטה לכמת חלקיקים זיהומיות של norovirus העכברי (MNV), שהוא היחיד שיעילות norovirus משכפל בתרבות תא. Assay פלאק מנצל הכמיהות של MNV למקרופאגים Murine ויכול להיות מותאם לשימוש עם דגימות ביולוגיות או סביבתיות המכילות MNV.
Abstract
norovirus Murine (MNV) הוא הנציג היחיד של סוג norovirus שיעילות גדל בתרבית רקמת 1, 2. תמוגה תא והשפעת cytopathic (CPE) הם נצפו במהלך MNV-1 זיהום של תאי דנדריטים Murine או מקרופגים 1. מאפיין זה של MNV-1 יכול לשמש כדי לכמת את מספר החלקיקים מזהמים במדגם שניתן על ידי ביצוע בדיקת רובד 1. Assay פלאק מסתמך על יכולתו של MNV-1 לlyse תאים וליצור חורים בשכבת תאים מחוברת, הנקראות לוחות 3.
טכניקות מרובות יכולות לשמש כדי לזהות זיהומים נגיפיים בתרבות רקמות, רקמות נקטפו, קלינית, ודגימות סביבתיות, אך לא לכל המידה את מספר החלקיקים מזהמים (למשל qRT-PCR). אחת הדרכים לכמת חלקיקים נגיפיים מידבקים הוא לבצע assay פלאק 3, שיתואר בהרחבה בהמשך. וריאציה על assay פלאק MNV היא פלואורידassay escent מיקוד, שבו אנטיגן MNV immunostained בmonolayers הסלולרי 4. בדיקה זו יכולה להיות מהירה יותר, שכן ביטוי האנטיגן נגיפי קודמת להיווצרות הפלאק. זה גם שימושי עבור titrating וירוסים מסוגלים ליצור את הפלאק. עם זאת, בדיקת מיקוד הניאון דורשת משאבים נוספים מעבר לאלו של assay פלאק, כמו נוגדנים ומיקרוסקופ כדי לספור יחידות מוקד יוצרים. זיהומיות MNV גם ניתן לכמת על ידי קביעת 50% מינון רקמות תרבות זיהומיים (TCID 50) 3. בדיקה זו מודדת את כמות הווירוס הנדרש כדי לייצר CPE ב50% מתאי תרבית רקמה מחוסנת ידי טיטרציה נקודת הסיום 5. עם זאת, מגבלתו של גילוי היא גבוהה יותר בהשוואה ל4 assay פלאק.
במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול assay פלאק שניתן להשתמש בו בצורה יעילה כדי לקבוע את מספר חלקיקי MNV זיהומיות להציג בדגימות ביולוגיות או סביבתיות 1, 4, 6. שיטה זו היא based על הכנת דילולים סידוריים 10-קיפול של דגימות MNV המכילים, המשמשים לחסן monolayer של תאים מתירנית (264.7 תאי macrophage Murine RAW). וירוס מותר לצרף לmonolayer התא לתקופת זמן נתונה ולאחר מכן aspirated לפני מכסה תאים עם תערובת של agarose ותקשורת סלולרית תרבות. אגר מאפשר את התפשטות צאצאים נגיפיים לתאים שכנים תוך הגבלת התפשטות לתאים הנמצאים בריחוק. כתוצאה מכך, תאים נגועים lysed וחורי טופס בmonolayer המכונים פלאק. עם התפשטותו של הווירוס מספקת, לוחות הפכו מכתימים הבא גלויה של תאים עם צבעים כמו אדום, ניטראלי, כחול תילן, או סגול גביש. בדילולים נמוכים, כל רובד נובע מחלקיק אחד מדבק נגיפי והצאצאים שלה, שהתפשט גם לתאים שכנים. לפיכך, לספור את מספר הלוחיות מאפשר לחשב יחידות שלט יוצרים (pfu) נוכחיות במדגם החי 3.
Protocol
Discussion
שיטת assay פלאק לMNV-1 מוצגת כאן היא דרך של כימות חלקיקי MNV זיהומיות. על ידי ביצוע פעולות assay המאוירים באיור 3, ניתן לקבל titers הנגיפי לשעתק. המגבלה של זיהוי של assay תלויה בדילול מתחיל בשימוש. כאשר מתחילים עם דילול 1:10 של מדגם, כמתואר לעיל, המגבלה של זיהוי של assay פלאק היא 10 pfu (כלומר, לוח 1 גלוי ב10 -1 דילול). מאחר וכל רובד מייצג וירוס אחד, assay פלאק יכול לשמש גם כדי לטהר אוכלוסיות משובטות של MNV באמצעות הרמת שלטים מבודדים והפצתם כפי שתוארה לעיל 1. בנוסף, טהרת הפלאק יכולה לשמש גם כדי להפריד בין אוכלוסיית וירוס בודדה מאוכלוסיות וירוסים מעורבות. הגבלה של שימוש assay פלאק לגילוי זיהום MNV היא שלא כל זני MNV יוצרים פלאק 4. עם זאת, ייתכן שניתן יהיה להתגבר על inability של כמה זני MNV, שבודדו מבעלי חיים, ליצירת פלאק ידי passaging וירוסים אלה התוקפים בתרבית הרקמה 7. חלופה לassay פלאק היא למדוד חלקיקים מזהמים באמצעות 50 טכניקת TCID 3, 4. assay זה מכמת את כמות הווירוס הנדרש כדי לייצר CPE ב50% מתאי תרבית רקמה מחוסנת לאחר דילולי נקודתי קצה ולוקח 1 שבוע כדי להשלים לMNV 4. בנוסף להיות איטי יותר מאשר assay פלאק, 50 assay TCID הוא גם לא רגיש כמו (מגבלה של זיהוי = 200 TCID 50 / מ"ל) בשל הרעילות של דגימות רקמה לתאי 264.7 RAW 4.
אף ששלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול תוארו לאורך הפרוטוקול, הסעיף הבא מספק סיכום כדי להקל על בעיות ירי. השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא להבטיח שתאי 264.7 RAW נשארים קיימא לאורך assay לתומך בשכפול נגיף. זה יכוללהיות במעקב בכל שלב של הבדיקה באמצעות מיקרוסקופ אור. כדאיויות תא מובטחת בשתי דרכים. ראשית, יש להיזהר לא לתת לתאים יתייבשו בזמן טיפול צלחות. לפיכך, צלחות מחוסנות אחד בכל פעם, התנדנדו בתקופת הזיהום, וצריכות להישאר סגורים כל פעם שהם לא מטופלים. שנית, הוסיפו פתרונות לתאים צריכים להיות מתאזנים ל ~ 37 ° C. יתר על כן, הוא חיוני לבריאות הכללית של 264.7 תאי RAW לשמור עליהם בתקשורת המכילה רעלן פנימי סרום נמוך (<10 איחוד האירופי / מ"ל), המגביל את ההפעלה של תאים. בנוסף, יש לנו נצפו שיעור כישלון גבוה יותר של assay פלאק בעת שימוש בתאים ממעבר 30 ומעלה. למרות שזה עשוי להשתנות ממעבדה למעבדה, חשוב לכלול ביקורת חיובית (למשל, דוגמה עם כייל נגיף ידוע) כדי להבטיח titers לשעתק, במיוחד כאשר באמצעות תאי 264.7 RAW מעבר גבוהים יותר. כדי להגביל את השימוש בתאי מעבר גבוהים יותר, מומלץ להקפיא את המבחנות של תחילת passaתאי ge עם קבלת 264.7 תאי RAW ולהתחיל תרבות חדשה מהבקבוקונים קפואים לעתים קרובות. להתחיל מחדש עם תרביות תאי מעבר נמוכות גם להיות שימושי כאשר תאים להציג מאפיינים שונו, כמו אי ספיקה לדבוק, שינויים במורפולוגיה של תאים (לדוגמה מסיבוב לדק והתפשט החוצה), או כאשר זיהום Mycoplasma זוהה. נקודה חשובה נוספת לשים לב להיא להבטיח שטיפי פיפטה משתנים בין דגימות ובמהלך הדילולים. זה יבטיח דילולים סידוריים מדויקים ולמנוע זיהום צולב בין דגימות. צעד אחד בפרוטוקול שבו ניתן להשתמש באותו קצה פיפטה שוב הוא כאשר דילולים סידוריים של אותו המדגם מתווספים לבארות. במקרה כזה, צריך להתחיל מבידוד המדולל ביותר ועד נמוך, ונמרצות פיפטה מעלה ומטה בעת עריכת דילול חדש.
פרוטוקול assay פלאק הוא amendable למספר שינויים. שינוי אחד שיכול להתבצע כאשר tכאן הם לא מספיק תאים לinoculating בארות בשתי עותקים, הוא להדביק רק טובה אחת לכל דילול. עם זאת, מאחר שנפח הבידוד הוא 0.5 מ"ל, מספר פלאק אז צריך להכפיל בפקטור של 2 לנרמל לpfu / מ"ל. Assay פלאק יכול גם להיות מותאם לשימוש עם כל שורת תאי חסיד אחרת שיכולה לתמוך בשכפול של MNV, ואת זה כבר תאר לmicroglial קו BV-2 התא העכברי 8. שינויים אחרים שניתן ליישם הם עיבודים שתוארו בפרוטוקולי assay פלאק שפותחו עבור וירוסים אחרים. במקרה של MNV, את השינויים הבאים כבר יושמו בהצלחה, השימוש בתאית מתיל במקום לוחית ים 9 agarose, וצביעת תאים בסגולים או מתילן הכחול במקום האדום ניטראלית 10, 11 גביש.
באופן כללי, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאם לפי צורך לכמת וירוסי פלאק יוצרים אחרים או שימוש לothאה וירוסים הגורמים לזיהומים בממוסס 264.7 תאי RAW, מה שהופך אותו לכלי שימושי לכמת חלקיקים נגיפיים מידבקים באופן כללי.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדת Wobus להערות והצעות קריטיות. העבודה במעבדה של CEW מומנה על ידי קרנות הזניקו מאוניברסיטת מישיגן, מענק פיתוח קריירה ממרכז NIH / NIAID מצוינות האזוריים לביו הגנה והמחקר העולה מחלות זיהומיות (RCE) תכנית, אזור V הגדול ' RCE 'אגמים (פרס NIH 1-U54-AI-057153) וNIH R01 AI080611. MBG-H. מומן על ידי הניסויי אימונולוגיה (NIH T32 A1007413-16) ואת המנגנונים המולקולריים בפתוגנזה של חיידקים (NIH T32 A1007528) מעניקה הכשרה לאוניברסיטת מישיגן. JBC מומן על ידי Coordenação דה Aperfeiçoamento דה דה pessoal Nível סופריור (שכמיות), ברזיליה, ברזיל.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM/ High glucose | Hyclone | SH30243.02 |
| 2x MEM | Gibco | 11935 |
| 100x Penicillin and streptomycin | Hyclone | SV30010 |
| 10 mM Non-essential amino acids | Hyclone | SH30238.01 |
| 1M HEPES | Hyclone | SH30237.01 |
| 200 mM (100x) L-glutamine | Hyclone | SH30034.01 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Hyclone | 10437, SH30070.02 |
| Sea Plaque Agarose | Lonza | 50100 |
| Neutral Red 0.33% | Sigma | N2889 |
| 1x PBS | Gibco | 10010 |
| 1.0 mm Zirconia/Silica beads | BioSpec Products | 11079110z |
| Model 35 Speed Rocker | Labnet | S2035 |
| Magna Lyser Instrument | Roche | 03358968001 |
| Raw 264.7 cell line | ATCC | TIB-71 |
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC |
Referências
- Wobus, C. E. Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages. PLoS Biol. 2, e432 (2004).
- Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis. Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).
- Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. Ch. 2. Fields Virology. 1, 25-58 (2007).
- Thackray, L. B. Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence. Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method for estimating 50% endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).
- Chachu, K. A. Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection. Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).
- Barron, E. L. Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute. PLoS ONE. 6, e21435 (2011).
- Cox, C., Cao, S., Lu, Y. Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line. Virology journal. 6, 196 (2009).
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
- Hyde, J. L. Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway. Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).
- Simmonds, P. Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses. Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).
