Zebrafisk representerar en kraftfull ryggradsdjur modell som har använts i sin helhet för metaboliska studier. Här beskriver vi ett snabbt sätt att mäta<em> In vivo</em> Metabolisk profil att utveckla zebrafisk som möjliggör en jämförelse av olika mitokondriella funktionsparametrar mellan genetiskt eller farmakologiskt manipulerade embryon, vilket ökar tillämpligheten av denna organism.
En växande mål inom ämnesomsättningen är att bestämma hur genetiken på olika aspekter av mitokondriell funktion. Förstå dessa relationer kommer att bidra till att förstå den bakomliggande etiologin för en rad sjukdomar kopplade till mitokondriell dysfunktion, såsom diabetes och fetma. Senaste framstegen inom instrumentering, har möjliggjort kontroll av distinkta parametrar för mitokondriell funktion i cellinjer eller explantat vävnad. Här presenterar vi en metod för en snabb och känslig analys av mitokondrie funktionsparametrar in vivo under zebrafisk embryonal utveckling med Sjöhäst biovetenskap XF 24 extracellulära flöde analysatorn. Detta protokoll använder Islet Capture mikroplattor där en enda embryo placeras i varje brunn, så mätning av bioenergetik, inklusive: (i) basal respiration, (ii) basal mitokondrie andning (iii) mitokondriell andning på grund av ATP-omsättning, (iv) mitokondriell okopplade andning eller prOton läcka och (iv) maximal andning. Använda denna metod embryonala parametrar zebrafisk andning kan jämföras mellan vildtyp och genetiskt förändrade embryon (mutant, gen överuttryck eller genen ÖVERVÄLDIGANDE) eller de manipulerade farmakologiskt. Det förväntas att spridningen av detta protokoll kommer att ge forskarna nya verktyg för att analysera den genetiska grunden för metabola sjukdomar in vivo i denna relevanta ryggradsdjur modell.
Zebrafisk är en väletablerad genetisk modell för både framåt (ENU mutagenes) och bakåt (Tilling, zink finger nukleas riktade knock-out, morfolino ÖVERVÄLDIGANDE) genetiska metoder 3,4, medan genfunktion i zebrafisk embryon kan också lätt blockeras eller aktiveras användning av selektiva farmakologiska föreningar specifika för de kodade produkterna. På grund av deras externa utveckling och liten storlek, zebrafisk embryon är särskilt lämpliga för metabolisk analys. Emellertid har robust mätning av metabola profil och mitokondriefunktion in vivo i zebrafisk embryon inte uppnåtts, med endast en preliminär beskrivning rapporterade 5. Seahorse analys utformades ursprungligen för cellbaserade metaboliska studier och har visat sig ge exakta och tillförlitliga resultat 6. Tillämpningen av denna nya metod för att zebrafisk embryon är betydande och sannolikt öka den bredare användningen av denna modell för metaboliska studier.
I denna studie visar vi mätningar av en rad andning parametrar i zebrafisk embryon med hjälp av Seahorse Analyzer, inklusive basala andning, maximal andning, extra respiratorisk kapacitet, ATP omsättning och proton läckage. Vi tillhandahåller också ett exempel på hur sådana mätningar kan korreleras med andra fysiologiska parametrar, i detta fall lipidackumulering, och av användningen av farmakologiska inhibitorer i detta analyssystem. Kombinerat med användningen av genetiskt förändrade embryon, ger detta en kraftfull experimentell plattform för att förstå faktorer som påverkar ämnesomsättningen.
Det finns en mängd olika tillämpningar för denna nya metod, med mitokondriell dysfunktion är inblandad i många humana sjukdomar, såsom diabetes mellitus 7, fetma 8, multipel skleros 9, Parkinsons sjukdom 10, Alzheimers sjukdom 11 och någon typ av cancer 12. Viktigt our arbetet utförs in vivo, där alla miljöpåverkan – såsom cytokiner, utvecklingsrelaterade tillväxt osv – är aktiva, vilket ger en fysiologiskt relevant utsikt in vivo andning och metabolisk profil. Som kemiska skärmar är också rutinmässigt utförs i vildtyp och muterade bakgrund embryon zebrafisk (figur 1), läkemedel roman som påverkar andning, mitokondrier funktion eller ämnesomsättning lätt kunde identifieras med hjälp av Seahorse analysatorn. De resultat som erhållits med hjälp av Seahorse analysatorn kan användas tillsammans med andra analyser för att ge ytterligare information. Detta kan inkludera fysiologisk analys, såsom olja-Röd färgning eller molekylär analys, såsom in situ hybridisering för specifika fettceller markörer såsom cebpα, PPARa, PPARy, FAS etc.
Det finns fortfarande vissa begränsningar för denna metod. Även om vi och andra skulle kunna använda oligomycin till MEAure ATP-produktion och proton läcka på unga embryon 5 (se figur 3), i embryon äldre än 60 HPF oligomycin behandling är ineffektiv. Vi tror att i äldre embryon oligomycin inte kan diffundera lika lätt än hos yngre embryon gör resultaten omöjliga att tolka. Eftersom Oligomycin resultaten är obligatoriska för bestämning av andning på grund av ATP omsättning och okopplade andning, undersöker vi för närvarande högre koncentrationer av oligomycin för äldre embryon. Men antimycin A behandlingar förblir effektiva längre, med andra mätningar, såsom basal andning, maximal andning och reservdelar respiratorisk kapacitet kan utföras i äldre zebrafisk embryon, upp till 68 HPF (visas ej).
En annan begränsning i att använda aktuella inställningar Sjöhäst Analyzer är det fysiska utrymmet inom varje ö fånga platta väl, så att de lämpar sig bara för zebrafisk embryon och unga larver. Därför, utför Metabolic studier om kost-inducerad fetma i vuxen fisk, till exempel, är ännu inte tekniskt möjligt. Dock kan denna studie också skynda på utvecklingen av plattor som är särskilt utformade för ung eller vuxen fisk, vilket utvidga analyserna möjligt.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka de anställda i Deakin University Zebrafish resurs för att ge utmärkt pågående djurhållning vård. YG stöds av en Alfred Deakin postdoktoral forskning Fellowship och en central forskningsbidrag från Deakin University. SLM stöds av en NHMRC karriärutveckling Fellowship. ACW stöds av en NHMRC Aktivera Grant. Alla författare stöds av Molecular & medicinsk forskning Strategisk forskning Centre vid Deakin University.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
E3 (embryonic medium) | Self made | – | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
FCCP | Sigma | C2920 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 |