Este artigo descreve a administração de Lux-marcado Bactérias a ratos e subseqüentes In vivo Análise usando IVIS imagem de bioluminescência.
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Artigo de método
Imagem bacteriana Bioluminescent
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este vídeo descreve o uso de todo o corpo bioluminesce imaging (BLI) para o estudo de tráfico bacteriana em ratos vivos, com ênfase no uso de bactérias na terapia génica e celular para o cancro. As bactérias presentes uma classe atraente de vetor para terapia de câncer, possuindo uma capacidade natural de crescer preferencialmente dentro de tumores após a administração sistêmica. As bactérias manipuladas para expressar o gene lux cassete autorização BLI detecção das bactérias e simultaneamente locais tumorais. A localização e níveis de bactérias ao longo do tempo dentro de tumores pode ser facilmente examinado, visualizado em duas ou três dimensões. O método é aplicável a uma ampla variedade de espécies bacterianas e tipos de xenoenxertos de tumor. Este artigo descreve o protocolo para a análise de bactérias bioluminescentes dentro ratinhos portadores de tumores subcutâneos. A visualização das bactérias comensais no tracto gastrointestinal (TGI) por BLI é também descrito. Este poderoso e barato, em tempo real representação estratégia de imagemts um método ideal para o estudo da bactéria in vivo no contexto da pesquisa de cancro, em particular, a terapia génica, e doenças infecciosas. Este vídeo descreve o procedimento para estudar lux-marcado E. coli em murganhos vivos, demonstrando a leitura espacial e temporal BLI alcançável utilizando o sistema IVIS.
Protocolo
1. Indução de tumores
- Para a indução do tumor de rotina, a dose tumorigénica mínima de células em suspensão em 200 uL de meio isento de soro da cultura foi injectado por via subcutânea (sc) no flanco de infecção livre 6-8 semanas de idade, ratinhos fêmea Balb / C ou atímicos MF1-nu/nu n = 6 (Harlan, Oxfordshire, Reino Unido) (1 x 10 6 células 4T1), utilizando uma agulha de seringa de calibre 21. A viabilidade de células utilizadas para inoculação foi superior a 95%, tal como determinado por contagem visual utilizando um hemocitómetro e Exclusão Trypan Blue Dye (Gibco).
- Seguindo estabelecimento do tumor, os tumores foram deixados cresce....
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Discussão
No contexto da terapia genética, o uso de agentes biológicos para a entrega de genes terapêuticos para pacientes mostrou uma grande promessa 3-5. Como vírus, as propriedades biológicas de bactérias inatas permitir a entrega eficiente do ADN a células ou tecidos, em particular no contexto do cancro. Tem sido demonstrado que as bactérias são naturalmente capazes de homing para tumores quando administrados sistemicamente, resultando em níveis elevados de replicação localmente, quer externas (para não-invasivos e.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer o apoio relevante para este manuscrito da Comissão Europeia Sétimo Programa-Quadro (PIOF-GA-2009-255466) e do Conselho de Pesquisa irlandês Saúde (HRA_POR/2010/138). Lux-marcado E. coli foi um presente tipo de Dr. Cormac Gahan, Universidade College Cork.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Linha celular 4T1 | ATCC | CRL-2539 | Modelo de cancro da mama singeneico derivado de um tumor espontâneo resultante BALB / c mamária |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Meio de Dulbecco Modificado de Eagle |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Solução salina tamponada com fosfato |
| Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | IVIS 100 para 2D imagem; IVIS Spectrum para 3D. | |
| Luria Broth Miller (LB) | Sigma-Aldrich | L2542 | O meio de crescimento para E. coli |
| Eritromicina | Sigma-Aldrich | E5389 | Antibiótico |
| Estreptomicina | Sigma-Aldrich | S9137 | Antibiótico |
| Camundongos MF1nu/nu | Harlan (UK) | 069 (nu) / 070 (nu / +) | Hsd: atímicos nu-Foxn1nu |
| Camundongos Balb / c | Harlan (UK) | 066 | Haplotipo H-2 d |
| Agulha de gavagem | Vet-Tech Solutions (UK) | DE009 | 22G x 38mm agulha reta gavagem |
| Seringa para injeção IV | BD BioSciences | 309309-1 ml | Seringa de insulina com 28 x ½ polegadas G micro-agulha fina IV. |
| Seringa para inoculação do tumor | Braun | 9161376V | Omnifix 26 G x ½ agulha polegadas |
Referências
- Cronin, M., et al. High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting. PLoS One. 7, e30940(2012).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstructio....
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Reimpressões e permissões
