نحن هنا وصف طريقة لتفعيل وتوسيع خلايا NKT من معظم السكان الخلية باستخدام خلايا T مستضد تقديم الاصطناعي (AAPC). استخدام CD1d القائم على AAPC يوفر طريقة موحدة لتوليد أعداد كبيرة من الخلايا NKT الوظيفية.
الطبيعية القاتلة T (NKT) الخلايا هي مجموعة فرعية من الخلايا T فريدة من نوعها التي تعرض علامات مميزة لكلا القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا وخلايا T 1. على عكس الخلايا T الكلاسيكية، وخلايا الدهون NKT الاعتراف مستضد في سياق CD1 جزيئات 2. الخلايا NKT إبداء ثابتة إعادة ترتيب سلسلة TCRα: Vα14Jα18 في الفئران والبشر في Vα24Jα18، الذي يرتبط مع سلاسل Vβ التنوع محدودة 3-6 و ويشار إليه على أنه الكنسي أو ثابتة خلايا (ط NKT) NKT. مماثلة لخلايا T التقليدية، وخلايا CD4 NKT تطوير من CD8-T-التوتة خلايا السلائف بعد إشارات مناسبة من CD1d 7. وزادت القدرة على الاستفادة من الخلايا لأغراض علاجية NKT بشكل كبير مع القدرة على تحفيز وتوسيع خلايا NKT مع Galactosylceramide-α (α-GalCer) ومجموعة متنوعة من السيتوكينات 8. الأهم من ذلك، احتفظت هذه الخلايا الأصلية phenotypه، السيتوكينات يفرز، وظيفة السامة للخلايا ضد عرض خطوط الخلايا السرطانية. وهكذا، الخلايا خارج الجسم الموسعة NKT تبقى وظيفية، ويمكن استخدامها لعلاج مناعي بالتبني. ومع ذلك، فقد اقتصرت القائمة على الخلية NKT العلاج المناعي عن طريق استخدام خلايا مستضد ذاتي تقديم وكمية ونوعية هذه الخلايا يمكن أن تختلف إلى حد كبير مشجعا. تم الإبلاغ عن الوحيدات المستمدة من DC مرضى السرطان للتعبير عن انخفاض مستويات جزيئات costimulatory وإنتاج السيتوكينات الالتهابية أقل 9،10. في الواقع، وقد استخدمت DC الفئران بدلا من APC ذاتي لاختبار وظيفة الخلايا من المرضى NKT CML 11. ومع ذلك، لا يمكن إلا أن هذا النظام يستخدم لاختبار في المختبر حيث لا يتم توسيع الخلايا NKT بواسطة DC الفئران وتستخدم بعد ذلك لعلاج مناعي بالتبني. وهكذا، يمكن لنظام موحد يعتمد على خلايا مستضد تقديم الاصطناعي (AAPC) تنتج على المؤثرات المحفزة للDC بدون مطبات أو ألو م أعضاء غير بشريةLLS 12 و 13. هنا، نحن تصف طريقة لتوليد CD1d القائم على AAPC. منذ إشراك مستقبلات الخلايا T (TCR) من CD1d مستضد المجمعات شرط أساسي لتنشيط الخلايا NKT، مستضد: مجمعات CD1d-IG توفر طريقة موثوق بها لعزل وتنشيطها وتوسيع المستجيب السكان الخلية NKT.
ويمكن استخدام AAPC لدراسة المتطلبات الأساسية لتنشيط الخلايا NKT ولها قيمة السريرية المجراة إمكانية التوسع السابقين من الخلايا T NK لعلاج مناعي بالتبني. وصف Mescher وآخرون واحد من أنظمة الأولى استنادا حبة، حيث المعقدة البيروكسيديز الطبقة MHC I-الفئران الببتيد واحد يبني سلسلة وجنبا إلى جنب مع جزيئات costimulatory المعقدة البيروكسيديز B7.1 وB7.2 عبر streptavidin على سطح المجهرية اللاتكس 14 و 15. وقد تم بنجاح هذا النهج المستخدمة لتحفيز المستضد محددة الخلايا T من الفئران المعدلة وراثيا. وبالإضافة إلى ذلك، لأن هذا النهج يستخدم احد سلسلة MHC-الببتيد المعقدة لضمان التحميل متجانسة من جزيئات MHC، فإن كل مستضد الببتيد الهدف يتطلب ترنسفكأيشن جديدة للتعبير عن المطلوب واحد مجمع الببتيد سلسلة MHC-، مما يحد من عمومية ما النهج. الأهم من ذلك، رائدة مجموعة الدكتور Schneck هو حبة القائم على AAPC، من خلال تطوير أخرى غير القائمة على حبة الخلوية AAPC، التي أدلى بها اقتران HLA-IG، إشارة 1، ومكافحة CD28، إشارة 2، على الخرز المغناطيسي. وقد وضعت HLA-IG، شكلا فريدا من multimeric HLA تنصهر إلى سقالة المناعي الجزيئي 16 و 17 من جماعته. بعد ذلك، أنها وضعت على أساس MHC-الإيج AAPC، والتي ثبت بشكل فعال لتوسيع CMV وMART-1 CTL محددة 18. هنا، لقد أثبتنا التي يمكن استخدامها CD1d-IG AAPC يستند إلى توسيع الخلايا الوظيفية NKT. وقد استخدمت إحدى الدراسات نظام مماثل لدراسة التفاعل المادي للخلايا NK مع CD1d 19.
والجدير بالذكر أن قمنا بتصميم خلية مستضد تقديم الاصطناعية التي هي قابلة للتكيف مع أي متطلبات نجد اللازمة لتكاثر الخلايا NKT الأمثل. طريقة توسيع AAPC يوفر طريقة بسيطة وموثوق بها لتوسيع وإثراء خلايا NKT. يمكن تعديل AAPC لدينا منهجية لتقييم دور لجنة من جزيئات costimulatory المحتملة وتقييم دورها في الخلية NKT proliferaنشوئها ووظيفتها. وهكذا، تمثل التكنولوجيا AAPC قوية تنوعا مفيدا لإحداث وتوسيع الخلايا NKT. توليد aAPCs تستغرق أقل من أسبوع واحد ومناسبة لإنتاج كميات كبيرة من الخرز. ومع ذلك، خطوة حاسمة في توليد AAPC هو للتأكد من أن يتم يجمد ثابت CD1d-الإيج على سطح حبات لتقييم وظائفها لضمان الاتساق من دفعة لدفعة واحدة. وجود قيود المحتملة لهذا النظام هو أنه لا يوجد آلية في مكان لإيقاف التحفيز، وغيرها من الإزالة الميكانيكية من الخرز. على وجه التحديد، وإشراك مستقبلات الخلايا T (TCR) مع المستضد: مجمع CD1d/MHC توليد عادة المشبك المناعية بالتنسيق مع الإكسسوارات / التصاق جزيئات، والتي يمكن أن تؤدي إلى تحريض من العوامل المثبطة أو الخلية القمعية على كل وT مستضد تقديم الخلايا. في نظام AAPC، قد يكون upregulated هذه العوامل من قبل خلية T، ولكن حبة لن تعبر عن يغاندس وما شابه ذلكلهذه المستقبلات.
وبالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت CD4 + الخلايا NKT لقمع ردود انتيتومور في الفئران والبشر، ولذلك فمن الممكن أن تفعيل الخلايا غير انتقائية لجميع NKT (أي التحفيز العالمية مع α-GalCer) أو تفعيل فرعية خاطئة يمكن أن يؤدي إلى المناعية غير المرغوب فيها النتائج. وبناء على ذلك، يجب على المرء ظاهريا وظيفيا تميز الخلية NKT-AAPC الموسع السكان. كما هو مبين في الشكل (4)، وجدنا أن التحفيز مع α-GalCer محملة AAPC معربا عن مكافحة CD28 يمكن أن يؤدي إنتاج خلايا NKT TH1، TH2، والسيتوكينات نوع Th17. وأفادت الدراسات أن الفئران التحدي مع IL-33، والتي تم تحديدها مؤخرا خلوى، أدى إلى زيادة مستويات تعميم السيتوكينات الالتهابية مثل IL-5 و13-IL. تعزيز العلاج للخلايا NKT مع IL-33 خلوى إنتاجها 20. IL-33 هو يجند محددة لST2 ولقد ثبت أن ذوبان ST2 كاليفورنيان كتلة IL-33 إشارة. وهكذا، وعلى سبيل المثال لتطبيقها في المستقبل، يمكن أن تتولد AAPC ST2 التعبير عن وتستخدم لتحديد ما إذا كان يمكن للمرء أن تمنع بشكل انتقائي إنتاج السيتوكينات TH2 بينما حمل TH1 خلوى من قبل خلايا إفراز NKT. وأفيد أيضا أن حقن الرابع كيلو بايت، معربا عن AAPC في C57BL / 6 الفئران أدى إلى انخفاض الانبثاث الرئة من 21 الورم. الأهم من ذلك، هذه البيانات تثبت أن حركة المرور AAPC إلى الرئة، وتمكن من تنشيط الخلايا T المستجيب مجموعات فرعية. لذلك، يمكن للمرء أن تولد أنواع متعددة من AAPC ودراسة التفاعل بين مجموعات فرعية محددة مستضد الخلايا T. لتلخيص، فإن هذه الدراسات تثبت أن يمكن استخدامها CD1d-IG AAPC القائم على استبدال APC الخلوية العادية، ويجب أن القدرة على تعزيز النهج السريرية الحالية لعلاج مناعي NKT القائم على بالتبني الخلية.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر بريانكا سوبراهمانيام مفيدة للمناقشات. وقد تنافس على الكتاب أي مصلحة مالية. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من الجمعية الأميركية للسرطان، NIH / NCI K01 CA131487، R21 CA162273، R21 CA162277، وP30 المناعة والأورام العلاج المناعي لبرنامج ويب TJ. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني للسرطان أو المعاهد الوطنية للصحة.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17-1440 | |
EasySep Human T Cell Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19051 | |
Allophycocyanin CD161 human mAb | Pharmingen | 550968 | |
EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
Anti-mouse IgG1 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-101 | |
Dimer XI Recombinant Soluble Dimeric Mouse CD1d:IG Fusion Protein | BD Biosciences | 557599 | |
Anti-CD28 mAb | Biolegend | 302914 | |
M-450 Epoxy beads | Life Technologies | 150-11 | |
Alpha-galactosylceramide (KRN7000) | Axxora, LLC | BML-SL232-0100 | |
RPMI 1640 Medium | Sigma Aldrich | R 0883 | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
Vitamin Solution | Gibco | 11120-052 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | ||
Ciprofloxacin | Alexis Biochemicals | 380-288-G025 | |
PE-Vα24Jα18 | Biolegend | 342904 | |
PE-Vα24 (Clone C15) | Beckman Coulter | A66907 | |
FITC-Vβ11 (Clone C21) | Beckman Coulter | A66905 | |
PE-CD1d | Biolegend | 123510 | |
PE anti mouse IgG1 | BD Biosciences | 556650 | |
FITC anti-mouse IgG2a | Biolegend | 407105 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190250 | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S8032 | |
Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440-00100 | |
EDTA | Sigma Aldrich | 431788 | |
IL-2 (Proleukin) | BD Biosciences | 354043 | |
Human AB Serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
Labquake Tube Rotator | Fisher Scientific | 13-687-10Q | |
BD Falcon 5 ml polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
Wheaton Glass Sample Vials with Cap | Fisher Scientific | Small (03-343-6A ) Large (03-343-6E) |