Här beskriver vi en metod för att aktivera och expandera humana NKT celler från bulk T-cell populationer med artificiella antigenpresenterande celler (AAPC). Användningen av CD1d-baserad AAPC ger en standardiserad metod för att generera ett stort antal av funktionella NKT celler.
Naturliga mördar-T (NKT) celler är en unik undergrupp av T-celler som visar markörer karaktäristiska för både naturliga mördar (NK)-celler och T-celler 1. Till skillnad klassiska T-celler, NKT-celler känner igen lipid antigen i samband med CD 1-molekyler 2. NKT-celler uttrycker en invariant TCRα kedja omlagring: Vα14Jα18 hos möss och Vα24Jα18 hos människor, som är förknippade med Vp kedjor av begränsad mångfald 3-6 och kallas kanoniska eller invariant NKT (i NKT-celler). Liknar konventionella T-celler, NKT celler utvecklas från CD4-CD8-tymusceller föregångare T följa lämplig signalering från CD1d 7. Möjligheten att utnyttja NKT celler för terapeutiska ändamål har ökat betydligt med förmågan att stimulera och utveckla mänskliga NKT celler med α-galaktosylceramid (α-GalCer) och en mängd olika cytokiner 8. Viktigt, behöll dessa celler sin ursprungliga phenotype, utsöndrade cytokiner och visade cytotoxisk funktion mot tumörcellinjer. Sålunda, ex vivo expanderade NKT celler förblir funktionell och kan användas för adoptiv immunterapi. Emellertid har NKT cellbaserad-immunoterapi varit begränsad genom användning av autologa antigenpresenterande celler och kvantiteten och kvaliteten av dessa stimulatorceller kan variera avsevärt. Monocyt-härledd DC från cancerpatienter har rapporterats uttrycka reducerade nivåer av samstimulerande molekyler och producera mindre inflammatoriska cytokiner 9,10. I själva verket, har murina DC snarare än autologa APC använts för att testa funktionen av NKT celler från CML-patienter 11. Emellertid kan detta system endast användas för in vitro-testning sedan NKT celler inte kan expanderas genom murin DC och sedan användas för adoptiv immunterapi. Således kan ett standardiserat system som bygger på konstgjorda antigenpresenterande celler (AAPC) producera stimulerande effekterna av DC utan de fallgropar av allo-eller xenogen ceLLS 12, 13. Häri beskriver vi en metod för att generera CD1d-baserad AAPC. Eftersom inkoppling av T-cell receptorn (TCR) genom CD1d-antigenkomplex är ett grundläggande krav för NKT cells aktivering, antigen: CD1d-Ig-komplex ger en tillförlitlig metod för att isolera, aktivera och expandera effektor NKT cellpopulationer.
AAPC kan användas för att studera de grundläggande kraven för NKT cellaktivering och det har potential kliniskt värde för ex vivo expansion av NKT-celler för adoptiv immunterapi. Mescher et al. Beskrev en av de första vulsten system, där biotinylerad murin MHC klass I-peptid-enkelkedjiga konstruktioner kombinerades med biotinylerade samstimulerande molekyler B7.1 och B7.2 via streptavidin till ytan av latex-mikrosfärer 14, 15. Detta tillvägagångssätt har med framgång använts för att stimulera antigenspecifika T-celler från transgena möss. Dessutom, eftersom detta tillvägagångssätt använder en enda kedja MHC-peptidkomplex för att säkerställa homogen laddning av MHC-molekyler, skulle varje mål peptidantigen kräva en ny transfektion för uttryck av den önskade enkelkedjiga MHC-peptidkomplex, vilket begränsar allmängiltigheten av tillvägagångssätt. Det är viktigt att pionjärer Dr Schneck grupp pärlan baserade-AAPC, genom att utveckla en icke-cellulära pärla baserad AAPC, Genom koppling HLA-Ig, signalen 1, och anti-CD28, signalen 2, på magnetiska pärlor. HLA-Ig, en unik multimer form av HLA smält till en immunglobulin molekylär byggnadsställning 16, 17 har utvecklats av hans grupp. Därefter utvecklade de MHC-Ig baserade AAPC, som har visat sig effektivt expandera CMV och MART-1-specifika CTL 18. Här har vi visat att CD1d-Ig baserade AAPC kan användas för att expandera funktionella NKT celler. En studie har använt ett liknande system för att undersöka den fysiska interaktionen av NK-celler med CD1d 19.
Särskilt har vi utformat en konstgjord antigenpresenterande cell som kan anpassas till de krav som vi finner nödvändiga för optimal NKT cellproliferation. Den AAPC expansion metod ger en enkel och tillförlitlig metod för att utvidga och berika människor NKT celler. Vår AAPC kan modifieras för att systematiskt utvärdera rollen av en panel av potentiella samstimulerande molekyler och bedöma deras roll på NKT cell proliferaning och funktion. Således AAPC utgöra en solid mångsidig teknik användbar för att framkalla och utvidga NKT celler. Genereringen av aAPCs tar mindre än en vecka och är lämplig för produktion av stora mängder av pärlor. Emellertid är ett kritiskt steg i att skapa en AAPC att bekräfta att CD1d-Ig stabilt immobiliseras på ytan av pärlorna och bedöma deras funktionalitet att säkerställa enhetlighet från sats till sats. En potentiell begränsning av systemet är att det inte är en mekanism för att stänga av stimuleringen, annan än mekaniskt avlägsnande av pärlorna. Specifikt ingreppet av T-cellreceptorn (TCR) med antigen: CD1d/MHC komplexet generera typiskt immunologiska synapsen tillsammans med accessoriska / adhesionsmolekyler, som kan resultera i induktion av inhiberande eller undertryckande faktorer på både T-cellen och antigenpresenterande cell. I det AAPC systemet, kan dessa faktorer vara uppreglerad av T-cellen, men kulan kommer inte uttrycka de besläktade ligandernaför dessa receptorer.
Dessutom har CD4 + NKT-celler visat sig undertrycka antitumör responser i möss och människor, det är därför möjligt att icke-selektiv aktivering av alla NKT celler (dvs. globala stimulering med α-GalCer) eller aktivering av fel delmängden kan resultera i oönskad immunologisk resultat. Följaktligen måste en fenotypiskt och funktionellt karakterisera AAPC expanderade NKT cellpopulationen. Såsom visas i fig 4, har vi funnit att stimulering med α-GalCer-laddad AAPC uttryckande anti-CD28 kan resultera NKT celler producerar Th1, Th2 och Th17 cytokiner typ. Murina studier har rapporterat att utmaningen med IL-33, en nyligen identifierad cytokin, resulterade i ökade nivåer av cirkulerande inflammatoriska cytokiner såsom IL-5 och IL-13. Behandling av NKT-celler med IL-33 ökat sin cytokinproduktion 20. IL-33 är en specifik ligand för ST2 och det har visat sig att lösliga ST2 CAn blockera IL-33-signalering. Sålunda, som ett exempel på en framtida tillämpning, skulle AAPC uttryckande ST2 genereras och användas för att bestämma om man kunde selektivt inhibera produktionen av Th2-cytokiner samtidigt inducera Th1 cytokinutsöndring av NKT celler. Det har också rapporterats att intravenös injektion av Kb-uttryckande AAPC till C57BL / 6 möss resulterade i minskad lungmetastas av tumör 21. Viktigt, visar dessa data att AAPC trafik till lungan och kan aktivera effektor-T-cell-underuppsättningar. Därför kunde en generera flera typer av AAPC och undersöka samspelet mellan antigenspecifika undergrupper T-cell. Sammanfattningsvis dessa studier visar att CD1d-lg baserad AAPC kan användas för att ersätta normala cellulära APC och måste potential att öka de nuvarande kliniska metoder för NKT cellbaserad-adoptiv immunterapi.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Priyanka Subrahmanyam för hjälp diskussioner. Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen. Detta arbete har finansierats med bidrag från American Cancer Society, NIH / NCI K01 CA131487, R21 CA162273, CA162277 R21 och P30 tumörimmunologi och immunterapi Program till TJ Webb. Innehållet är endast ansvar författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Cancer Institute och National Institutes of Health.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17-1440 | |
EasySep Human T Cell Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19051 | |
Allophycocyanin CD161 human mAb | Pharmingen | 550968 | |
EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
Anti-mouse IgG1 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-101 | |
Dimer XI Recombinant Soluble Dimeric Mouse CD1d:IG Fusion Protein | BD Biosciences | 557599 | |
Anti-CD28 mAb | Biolegend | 302914 | |
M-450 Epoxy beads | Life Technologies | 150-11 | |
Alpha-galactosylceramide (KRN7000) | Axxora, LLC | BML-SL232-0100 | |
RPMI 1640 Medium | Sigma Aldrich | R 0883 | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
Vitamin Solution | Gibco | 11120-052 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | ||
Ciprofloxacin | Alexis Biochemicals | 380-288-G025 | |
PE-Vα24Jα18 | Biolegend | 342904 | |
PE-Vα24 (Clone C15) | Beckman Coulter | A66907 | |
FITC-Vβ11 (Clone C21) | Beckman Coulter | A66905 | |
PE-CD1d | Biolegend | 123510 | |
PE anti mouse IgG1 | BD Biosciences | 556650 | |
FITC anti-mouse IgG2a | Biolegend | 407105 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190250 | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S8032 | |
Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440-00100 | |
EDTA | Sigma Aldrich | 431788 | |
IL-2 (Proleukin) | BD Biosciences | 354043 | |
Human AB Serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
Labquake Tube Rotator | Fisher Scientific | 13-687-10Q | |
BD Falcon 5 ml polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
Wheaton Glass Sample Vials with Cap | Fisher Scientific | Small (03-343-6A ) Large (03-343-6E) |