人类多能干细胞的神经元在一个Multititre的板格式的快速和高效地生成
Summary
人类多能性干细胞（神经元分化hPSCs）的协议往往是费时的，并需要大量的细胞培养的技能。在这里，我们已经适应了小分子的分化过程，一个multititre板格式，可以简单，快速，高效的人类神经元的产生可控制的方式。
Abstract
现有的协议从人类多能干的细胞（hPSCs）的神经元的产生往往是繁琐的，因为它们是多步程序涉及的分离和扩增的神经前体细胞，细胞的终末分化之前。在这些耗时的方法相比，我们最近发现，从hPSCs，随后立即分化为功能性神经元相结合，抑制信号转导通路，TGFβ/SMAD2，BMP/SMAD1，和FGF / ERK，促进快速诱导神经外胚层。在这里，我们已经适应了我们的程序一种新型的multititre板的格式，以进一步提高其可重复性和吞吐量的应用程序中，使其符合。它包括四个天的神经外胚层形成在浮动球（胚状体），其次由进一步4天，分化成神经细胞的粘附条件下。本协议获得的大多数细胞是双极性感觉神经元。此外，高效的程序，是不需要特别的专业技能，是基于一个简单的化学介质，具有成本效益的小分子。由于这些特点，该过程可作为一个有用的平台，为进一步功能研究以及基于细胞的筛选采用，但需要的任何类型的人体感觉神经细胞或神经元。
Introduction
hPSCs，其特征在于，包括胚胎衍生的人胚胎干细胞（胚胎干细胞），诱导式多能性干细胞（人iPS细胞），是多能干细胞的，这意味着它们可以带来各种体外1-2细胞谱系。许多已分化的细胞类型，支持最新的来自人类胚胎干细胞，这些细胞的科研和基于细胞的筛选方法，提出了有价值的工具和细胞为基础的治疗方法有希望的概念。
人胚胎干细胞的神经元的分化协议通常是复杂和耗时的，因为它们通常是基于第一引导整体神经命运，然后通过手动隔离的神经祖细胞，分化成一个给定的神经元类型感兴趣的3-6和随后的终端。在某些方面，这种复杂性是不令人惊讶的和不可避免的，因为这种状态的最先进的定向分化协议，以逐步趋向模仿人类发展的早期，which是在本身极为复杂。另一方面，它可能会在部分也反映了我们缺乏了解潜在的分子过程，造成分化的协议还远远没有得到充分的优化。
的未分化的hPSCs转换成神经外胚层，佩拉等方面。发现，抑制BMP / SMAD1/5/8的信令增强了人类胚胎干细胞神经诱导7。此外，SMAD2 / 3信号的失活已被证明能促进神经外胚层形成8。因此，结合这两种途径的失活会导致更有效的神经诱导hPSCs 4,9。最近，我们已经表明，三分之一的信号转导通路，FGF / ERK，作为最早的步骤的神经外胚层承诺在人类胚胎干细胞强大的阻遏。相反，同时压制所有这三种途径导致近均匀的胚胎干细胞转化成神经外胚层在短短的四天10。随后，高效的终端分化为功能性神经元观察到八天之内。得到的神经元可能是感觉神经元的外周神经系统，这可能部分解释了他们的快速推导10。感觉神经元的维护中的缺陷被认为是某些人类疾病如家族性自律神经失调11的一个原因。对于这类疾病的建模基于hiPSC技术12，为进一步的功能特性，以及为应用的目的，不需要任何特定类型的神经元，这种分化过程可能存在一个有用的基础。
然而，我们最初采用差异化策略参与胚体形成的团块（EBS）从人类胚胎干细胞的殖民地10，这造成了相当程度的异质性EB尺寸，也出现了妥协神经元形成在某些行政长官效率LL线。此外，由于的异质性EB尺寸，能力，系统测试期间和之后的额外生长因子或小分子神经元形成的影响似乎有点混淆。
在这份报告中，我们调整了我们的前面的过程中等吞吐量兼容，被迫聚集为基础的新技术，将EBS的一个高度规模控制的方式，也显示在其他情况下13。随后，生成的类胚体在V形的96孔板的孔中，被转移到U形的超低附件96 – 孔板中，，发起神经外胚层形成悬浮液中。四天之后，胚体可以镀出，引起终末分化的神经元，在高效率和均匀性。或者，天-4类胚体分离成单个细胞，这样，这导致人类的神经元的低密度单层镀出。迄今获得的两个独立的相干结果甚巨，人类胚胎干细胞的线，HuES6和三氯化氮。
作为先决条件，成功的EB形成严格依赖于使用的是合成聚合物，聚乙烯醇（PVA），连同已知可促进胚胎干细胞的生存13-14的 ROCK抑制剂的Y-27632。其结果是，形成的类胚体的均匀性在96-V-板大幅提高相比，作为基于随机分裂技术的大规模培养的类胚体中的形成。因此，该系统提供了一种显着改善的平台神经外胚层形成悬浮培养，然后通过粘合条件下的高度控制的神经元形成。
Protocol
Representative Results
Discussion
大多数分化协议涉及EB形成从hPSCs，包括我们之前发表的过程10，是基于手动或作为骨料，这不可避免地导致异质性的EB大小的人类胚胎干细胞的酶辅助的收获。这一事实导致分化效率与某些细胞系中的可变性，从而使系统的分析困难的，特别是在一个中等的吞吐量规模。此外，人工清扫是劳动密集型的，这本身损害的可扩展性。
与此相反，这里描述的方法是根据对EB?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由马克斯·普朗克协会。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. |
Referências
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Pera, M. F., et al. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity. Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).
- Greber, B., et al. FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).
- Anderson, S. L., et al. Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene. Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
