تشريح والمناعية من اليرقات، العذراء وتعليم الكبار<em> ذبابة الفاكهة</em> شبكية العين
Summary
ال<em> ذبابة الفاكهة</em> شبكية العين هو الكريستال المشبك مثل تتألف من عدد صغير من أنواع الخلايا التي يتم إنشاؤها بطريقة نمطية<sup> 1</sup>. قابليته لالتحليل الجيني تطورا يسمح للدراسة البرامج التنموية المعقدة. يصف هذا البروتوكول تشريح والمناعية من شبكية العين في المراحل الثلاث المنفصلة التنموية، مع التركيز على التمايز مبصرة.
Abstract
العين ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا مجمع يتكون من نحو 750 ommatidia (عيون وحدة). ويتألف كل مقيلة من حوالي 20 الخلايا، بما في ذلك الخلايا المخروطية عدسة إفراز، الخلايا الصبغية، خلية الشعر الخشن وثمانية خلايا مستقبلة للضوء (PRS) R1-R8 2. استراتيجية الحد من الفقر لديها هياكل متخصصة microvillar، وrhabdomeres، والتي تحتوي على أصباغ حساسة للضوء، وRhodopsins (RHS). وrhabdomeres ستة المستفيدين الرئيسيين (R1-R6) تشكيل شبه منحرف وتحتوي على RH1 3 4. يتم وضع rhabdomeres من R7 R8 وجنبا إلى جنب في وسط شبه منحرف، وتقاسم نفس المسار للضوء. R7 R8 والمستفيدين الرئيسيين التعبير عن عشوائيا مجموعات مختلفة من RHS في نوعين الرئيسي 5: في النوع الفرعي 'ع'، ويقترن RH3 في R7s ف مع RH5 في R8s ف، في حين أنه في النمط الفرعي 'ذ'، ويرتبط RH4 في R7s Y مع RH6 في ذ R8s 6 7 8.
مواصفات الأولى من المستفيدين الرئيسيين وتطوير ommatidia يبدأ في القرص العين antennal اليرقات تخيلي، أحادي الطبقة من الخلايا الظهارية. موجة من التمايز الاحتلالات عبر القرص 9 و يبدأ التجمع من خلايا غير متمايزة في ommatidia 10-11. ويتم تحديد R8 'خلية مؤسس' الأول وتجند R1-6 ثم R7 12-14. في وقت لاحق، خلال التنمية العذراء، PR التمايز يؤدي إلى تغيرات شكلية واسعة 15، بما في ذلك تشكيل rhabdomere، synaptogenesis والتعبير RH في نهاية المطاف.
في هذا البروتوكول، ونحن تصف أساليب تشريح الشبكية والمناعية في ثلاث فترات محددة من التنمية شبكية العين، والتي يمكن تطبيقها لمعالجة مجموعة متنوعة من المسائل المتعلقة بتشكيل الشبكية ومسارات التنمية. هنا، ونحن نستخدم هذه الأساليب لتصور التمايز التدريجي PR على مستوى وحيدة الخلية في جبل اليرقات كله، وشبكية العين midpupal الكبار ( <sترونج> الشكل 1).
Protocol
Discussion
1. استكشاف الأخطاء وإصلاحها
في تجربتنا، تتطلب تشريح الممارسة (تصل إلى عدة أسابيع) ويسر من خلال تحقيق موقف اليد مريحة القرن 21 يستريح المرفقين والساعدين على الطاولة ومع الأصابع إجراء اتصالات مع طبق تشريح. وبهذه الطريقة، الابها?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل الزمالة ايرمان لHY. H.، تابوت جين الصندوق التذكاري لزمالة تشايلدز البحوث الطبية ما بعد الدكتوراه لRJJ، NIH منح F32EY016309 إلى DV، زمالة جامعة ولاية نيويورك العميد أطروحة لDJ، NIH GrantR01 EY13010 إلى CD وزمالة DFG إلى JR (RI 2208/1- 1). نشكر نينا فوغت وBoodram باميلا للتعليقات على المخطوط.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
Referências
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Hardie, R. C., D, O. t. t. o. s. o. n. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. 5, 1-79 (1985).
- O’Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
- Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
- Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
- Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
- Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
- Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
- Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
- Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
- Wolff, T., Sullivan, W. e. a. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. , (2000).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
- Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genética. 152, 1631-1639 (1999).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
- Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
- Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
- Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).
