Вскрытие и иммуногистохимического личинок, куколок и взрослых<em> Drosophila</em> Сетчатки
Summary
<em> Drosophila</em> Сетчатка представляет собой кристалл типа решетки состоят из небольшого числа типов клеток, которые образуются в стереотипно<sup> 1</sup>. Его ответственность в сложный генетический анализ позволяет изучать сложные программы развития. Этот протокол описывает вскрытия и иммуногистохимии сетчатки на три отдельных стадий развития, с акцентом на фоторецептор дифференциации.
Abstract
Соединение глаз дрозофилы состоит из около 750 омматидиев (блок глаз). Каждый ommatidium состоит из около 20 клеток, в том числе объектив-секретирующих клеток конуса, пигментные клетки, клетки щетины и восемь фоторецепторов (ОР) R1-R8 2. ОР имеют специализированные структуры микровиллярные, рабдомерами, которые содержат светочувствительные пигменты, родопсины (РИТ). Рабдомерами шесть ОР (R1-R6) образуют трапецию и содержат Rh1 3 4. Рабдомерами из R7 и R8 расположены в тандеме в центре трапеции и один и тот же путь света. R7 и R8 ОР стохастически выражают различные комбинации РИТ в двух основных подтипов 5: В подтипа 'P', Rh3 в р R7s сочетается с Rh5 в р R8s, в то время как подтип 'у', у Rh4 в R7s связано с В Rh6 у R8s 6 7 8.
Ранние спецификации ОР и развития омматидиев начинается в личиночной глаз усиков имагинальных дисков, монослой эпителиальных клеток. Волна дифференциация проводится над всей поверхностью диска 9 и инициирует собрание недифференцированных клеток в омматидиев 10-11. R8 'основатель ячейки указан первым и принимает на работу R1-6, а затем R7 12-14. Впоследствии, во время развития куколки, PR дифференциация приводит к обширным морфологические изменения 15, в том числе рабдомера образования, синаптогенез и в конечном итоге относительная влажность выражение.
В этом протоколе описываются методы вскрытия сетчатки и иммуногистохимии на трех определенные периоды развития сетчатки, которые могут быть применены для решения различных вопросов, касающихся сетчатки формирования и пути развития. Здесь мы используем эти методы для визуализации ступенчатой дифференциации PR в одной клеточном уровне в целом крепление личиночной, midpupal и взрослых сетчатки ( <sЧонг> рис. 1).
Protocol
Discussion
1. Поиск и устранение неисправностей
По нашему опыту, требующие вскрытия практике (до нескольких недель) и способствует достижению удобное положение рук 21, отдыхая локтями и предплечьями на стол и с помощью пальцев контакта с рассечение блюдо. Таким образом, только п…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана общение Эрман к HY. Х., Джейн Гроб Дети Мемориальный фонд медицинских исследований докторской стипендии для RJJ, NIH Грант F32EY016309 Д. В., Диссертация стипендий Нью-Йоркского университета Дина DJ, NIH GrantR01 EY13010 на компакт-диски и DFG стипендии для JR (RI 2208/1- 1). Мы благодарим Нины Фогт и Памела Boodram замечания по рукописи.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
Referências
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Hardie, R. C., D, O. t. t. o. s. o. n. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. 5, 1-79 (1985).
- O’Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
- Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
- Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
- Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
- Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
- Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
- Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
- Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
- Wolff, T., Sullivan, W. e. a. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. , (2000).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
- Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genética. 152, 1631-1639 (1999).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
- Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
- Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
- Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).
