Détermination des acidités en phase gazeuse d'oligopeptides
Summary
La détermination des acidités en phase gazeuse d'oligopeptides contenant de la cystéine est décrite. Les expériences sont réalisées à l'aide d'un spectromètre de masse quadripolaire triple. Les acidités relatives des peptides sont mesurées à l'aide d'expériences de dissociation induite par collision, et les acidités quantitatives sont déterminées en utilisant les cuisiniers de longues méthode cinétique.
Abstract
Les résidus d'acides aminés situés à des positions différentes dans les protéines pliées présentent souvent des degrés différents de acidités. Par exemple, un résidu cystéine situé dans ou près de l'extrémité N-terminale d'une hélice est souvent plus acide que celui au niveau ou près de l'extrémité C-terminale de 1 à 6. Bien que de vastes études expérimentales sur les propriétés acide-base de peptides ont été réalisées dans la phase condensée, en particulier dans des solutions aqueuses 6-8, les résultats sont souvent compliquées par les effets de solvant 7. En fait, la plupart des sites actifs dans les protéines sont situés près de la zone intérieure où les effets de solvant ont été réduites au minimum 9,10. Afin de comprendre les propriétés acido-basiques intrinsèques de peptides et de protéines, il est important d'effectuer des études dans un environnement exempt de solvant.
Nous présentons une méthode pour mesurer les acidités des oligopeptides dans la phase gazeuse. Nous utilisons un contenant de la cystéine oligopeptides, Ala 3 CysNH <sUB> 2 (CH 3 A), en tant que composé modèle. Les mesures sont basées sur la méthode Cooks prolongée bien établie cinétique (figure 1) 11-16. Les expériences sont réalisées à l'aide d'un spectromètre de masse quadripolaire triple interfacé avec une ionisation par électrospray (ESI) de la source d'ions (figure 2). Pour chaque échantillon de peptide, de plusieurs acides de référence sont sélectionnées. Les acides de référence sont des composés organiques ayant une structure similaire acidités-en phase gazeuse connu. Une solution du mélange du peptide et un acide de référence est introduit dans le spectromètre de masse, et le groupe anionique en phase gazeuse proton lié d'acide peptide-référence est formée. Le cluster proton-bound est masse isolée et ensuite fragmenté par dissociation expériences induite par collision (CID). Les abondances d'ions fragments obtenus sont analysés en utilisant une relation entre les acidités et le cluster ion cinétique de dissociation. L'acidité en phase gazeuse du peptide est ensuite obtenie par régression linéaire des parcelles thermo-cinétiques 17,18.
La méthode peut être appliquée à une variété de systèmes moléculaires, y compris les composés organiques, les acides aminés et leurs dérivés, les oligonucléotides et oligopeptides. En comparant les acidités en phase gazeuse mesurées expérimentalement avec les valeurs calculées pour les différentes conformations, les effets conformationnels sur les acidités peuvent être évalués.
Introduction
Les acidités de résidus d'acides aminés sont parmi les plus importantes propriétés thermochimiques qui influent sur les structures, la réactivité, et les processus de pliage-dépliage des protéines 9,19. Résidus d'acides aminés individuels présentent souvent différentes acidités efficaces en fonction de leurs emplacements dans les protéines. En particulier, les résidus situés sur les sites actifs présentent souvent considérablement perturbé acidités. Un exemple est le résidu cystéine qui résident dans les sites actifs de la super-famille des enzymes 20,21 thiorédoxine. La cystéine du site actif est anormalement acide par rapport à celles de protéines dépliées 3-5. Il a été suggéré que la conformation hélicoïdale peut avoir une contribution significative à l'acidité inhabituelle. Il ya de vastes études expérimentales sur les propriétés acide-base de peptides menées dans les solutions, en particulier dans des solutions aqueuses 2,6-8. Les résultats ont souvent été compliquées par les effets de solvant7. En fait, la plupart des sites actifs dans les protéines sont situés près de la zone intérieure où les effets de solvants sont réduites au minimum 9,10.
Afin de comprendre les propriétés acido-basiques intrinsèques de peptides et de protéines, il est important de réaliser les études dans un environnement exempt de solvant. Nous présentons ici une méthode basée sur la spectrométrie de masse pour la détermination de l'acidité en phase gazeuse. L'approche est appelée la méthode cinétique Cooks prolongée. Cette méthode a été appliquée avec succès à un large éventail de systèmes chimiques pour la détermination des différentes propriétés thermodynamiques, telles que l'acidité en phase gazeuse, l'affinité protons, les ions de l'affinité du métal, l'affinité électronique et l'énergie d'ionisation 11-15, 22-26. Nous avons appliqué cette méthode pour déterminer les acidités en phase gazeuse d'une série d'oligo-cystéine polyalanine et la cystéine-polyglycine peptides 17,18,27. Ces études montrent que la cystéine N-terminal Peptides sont beaucoup plus acides que celles C-terminaux correspondants. Les acidités élevées de l'ancien sont probablement dues à des effets de conformation hélicoïdale dont l'anion thiolate est fortement stabilisée par l'interaction avec l'hélice macro-dipôle. En raison de la nature non-volatiles et thermolabiles de peptides, la méthode cinétique est l'approche la plus pratique disponible à l'heure actuelle pour produire de l'acide-base des quantités thermochimiques raisonnablement précises de peptides 28.
Le régime général et l'équation associée à la méthode cinétique sont présentés dans la figure 1. La détermination de l'acidité en phase gazeuse d'un peptide (AH) commence par la formation d'une série d'anions de la grappe de protons liés, [A • h • A i] ¯ (ou [A ¯ • H + • A i ¯] ¯), dans la région de la source d'ions du spectromètre de masse, où A et A i ¯ ¯ sont les formes déprotonés du peptide etles acides de référence, respectivement. Les acides de référence sont des composés organiques avec des acidités-en phase gazeuse connu. Les acides de référence doivent avoir des structures semblables à l'autre (mais pas nécessairement similaire à celui du peptide). La similitude des structures entre les acides de référence assure la similitude des entropies de déprotonation parmi eux. Le cluster proton-bound anions sont choisis masse et par collision activés et ensuite dissocié en utilisant dissociation expériences induite par collision (CID) pour donner des anions monomères correspondants, A et A i ¯ ¯, avec des constantes de vitesse de k et k i, respectivement, à la figure 1a. Si fragmentations secondaires sont négligeables, le rapport d'abondance des ions fragments CID, [A ¯] / [A i ¯], représente une mesure approximative du rapport des constantes de vitesse, k / k i. Dans l'hypothèse où il n'y a pas activà inverseles barrières d'ions pour les deux canaux de dissociation, l'ion produit CID rapports de branchement, ln [A ¯] / [A i ¯], sera linéairement corrélée à l'acidité en phase gazeuse du peptide (Δ acide H) et ceux des acides de référence (acide Δ H i), comme le montre la figure 1b. Dans cette équation, l'acide Δ H moyenne est de l'acidité en phase gazeuse moyenne des acides de référence, Δ (Δ S) est le terme entropie (qui peut être supposée constante si les acides de référence sont structurellement similaires les unes aux autres), R est l' constante de gaz universelle, et T eff est la température effective du système. La température effective est un paramètre empirique qui dépend de plusieurs variables expérimentales, dont l'énergie de collision.
La valeur de l'acidité en phase gazeuse est déterminé par la construction de deux ensembles d'emplacements thermo-cinétiques. La première série est obcontenues en traçant ln ([A ¯] / [A i ¯]) contre l'acide Δ H i – acide Δ H moyenne, comme le montre la figure 4a. La régression linéaire donnera une série de lignes droites avec des pentes de X = 1 / RT eff et intercepte de Y = – [Δ acide H – acide Δ H avg] / RT eff – Δ (Δ S) / R. La deuxième série de parcelles est obtenue en traçant les intersections obtenues (Y) de la première série contre les pentes correspondantes (X), comme le montre la figure 4b. La régression linéaire produit une nouvelle ligne avec une pente de Δ acide H – acide Δ H moyenne et une interception de Δ (Δ S) / R. La valeur de Δ acide H est alors obtenue à partir de la pente et le terme entropie, Δ (Δ S), est obtenu à partirl'interception.
Les expériences sont réalisées à l'aide d'un spectromètre de masse quadripolaire triple relié à une ionisation par électrospray (ESI) de la source d'ions. Un schéma de principe du spectromètre de masse est illustrée à la figure 2. Les expériences CID sont effectuées en masse sélectionner les anions de cluster protons liés avec la première unité de quadripolaire et en leur permettant subissent des collisions avec des atomes d'argon fuites dans la chambre de collision qui est maintenue à une pression d'environ 0,5 mTorr. Les ions de produit de dissociation de masse sont analysés avec la troisième unité de quadripôle. Les spectres CID sont enregistrés à plusieurs énergies de collision avec la gamme m / z suffisamment large pour couvrir tous les fragments secondaires possibles. Les intensités d'ions sur les produits CID sont mesurées par l'instrument de mise en surveillance de réaction choisie (SRM) du mode dans lequel le balayage est focalisé sur des ions de produit sélectionné. Les expériences CID sont effectués à quatre différentes énergies de collision, ce qui correspond àénergies centre de masse (E cm) de 1,0, 1,5, 2,0, et 2,5 eV, respectivement. L'énergie dans le centre de masse est calculé en utilisant l'équation: E cm = E laboratoire [m / (m + m)], où E laboratoire est l'énergie de collision dans le référentiel du laboratoire, m est la masse de l'argon, et M est la masse de l'ion de grappe proton lié.
Dans cet article, nous utilisons les oligopeptides Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) comme composé modèle. L'extrémité C-terminale est amidée, et le groupe thiol (SH) du résidu de cystéine sera le site acide. La sélection des acides de référence appropriés est crucial pour le succès de mesure de l'acidité en phase gazeuse. Les acides de référence idéales sont structurellement similaires (les unes aux autres) des composés organiques ayant des valeurs d'acidité en phase gazeuse bien établies. Les acides de référence doivent avoir des valeurs d'acidité à proximité de celle des peptides. Pour le peptide A 3 CH, six halogénés carboxyliqueacides C sont choisis comme les acides référence. Les six acides de référence sont l'acide chloracétique (MCAH), l'acide bromoacétique (MBAH), de l'acide difluoroacétique (DFAH), l'acide dichloroacétique (DCAH), de l'acide dibromoacétique (DBAH), et trifluoroacétique (TFAH). Deux d'entre eux, DFAH et MBAH, seront utilisés pour illustrer le protocole.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mesure réussie de l'acidité en phase gazeuse d'un peptide repose en grande partie sur le choix des acides de référence appropriés. Les acides de référence idéales sont des composés organiques de structure similaire présentant des valeurs d'acidité en phase gazeuse bien établies. Les acides de référence doivent avoir des structures semblables les uns aux autres. Cela permettra d'assurer une entropie similaire de la déprotonation de chacun des acides de référence de l'ensemble. Les …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Mass Spectrometer | Varian | 1200 L and 320 L | |
| Chloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 402923 | |
| Bromoacetic acid | Sigma-Aldrich | B56307 | |
| Difluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 142859 | |
| Dichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | D54702 | |
| Dibromoacetic acid | Sigma-Aldrich | 242357 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 |
Referências
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