Bestimmung der Gas-Phase Aciditäten von Oligopeptides

Summary

Die Bestimmung der Gasphase Acidität von Cystein enthaltenden Oligopeptide beschrieben. Die Experimente werden unter Verwendung eines Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer. Die relativen Aciditäten der Peptide werden mit Stoßfragmentierung Experimente, und die quantitative Aciditäten werden unter Verwendung der erweiterten Cooks kinetische Methode.

Abstract

Aminosäurereste an verschiedenen Positionen in gefalteter Proteine ​​liegen häufig eine unterschiedliche Grade der Acidität. Zum Beispiel ist ein Cystein-Rest am oder nahe dem N-Terminus einer Wendel liegt oft saurer als das bei oder in der Nähe des C-Terminus ^1-6. Obwohl umfangreiche experimentelle Untersuchungen über die Säure-Base-Eigenschaften von Peptiden wurden in der kondensierten Phase, insbesondere in wässrigen Lösungen ^6-8 durchgeführt, werden die Ergebnisse oft durch Lösungsmitteleffekte ⁷ kompliziert. In der Tat sind die meisten der aktiven Stellen in Proteinen in der Nähe des inneren Bereichs, wo Lösungsmittel-Effekte wurden ^9,10 haben minimiert wird. Um intrinsische Säure-Base-Eigenschaften von Peptiden und Proteinen zu verstehen, ist es wichtig, die Studien in einer lösungsmittelfreien Umgebung durchzuführen.

Wir präsentieren eine Methode, um die Aciditäten Oligopeptide in der Gasphase zu messen. Wir verwenden eine Cystein enthaltenden Oligo-, Ala ₃ CysNH <sub> 2 (A ₃ CH), als Modell Verbindung. Die Messungen werden auf dem gut etablierten erweiterten Cooks kinetische Methode (Abbildung 1) ^11-16 bezogen. Die Experimente werden unter Verwendung einer Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer eine Schnittstelle mit einer Elektrospray-Ionisations (ESI)-Ionenquelle (Abbildung 2). Für jedes Peptid Beispiel werden mehrere Referenz Säuren. Die Referenz-Säuren sind strukturell ähnliche organische Verbindungen mit bekannten Gasphase Aciditäten. Eine Lösung der Mischung aus dem Peptid und einem Referenz Säure in das Massenspektrometer eingeführt wird, und ein Gas-Phasen Proton-gebundene anionische Gruppe von Peptid-Referenz Säure gebildet wird. Das Proton-gebundene Cluster Masse isoliert und anschließend über Stoßfragmentierung (CID) Experimente fragmentiert. Die entstehenden Fragmentionen Häufigkeiten werden analysiert unter Verwendung einer Beziehung zwischen der Acidität und Clusterion Dissoziationskinetik. Das Gasphasen-Acidität des Peptids wird dann obtainiert durch lineare Regression der thermo-kinetischen Grundstücke ^17,18.

Das Verfahren kann auf eine Vielzahl von molekularen Systemen, einschließlich organischer Verbindungen, Aminosäuren und deren Derivate, Oligonukleotide und Oligopeptide eingesetzt werden. Durch den Vergleich der Gasphase Acidität experimentell mit den Werten für verschiedene Konformere berechnet gemessen wird, kann Auswirkungen auf die Konformation Acidität ausgewertet werden.

Introduction

Die Aciditäten Aminosäurereste gehören zu den wichtigsten thermochemischen Eigenschaften, die die Strukturen zu beeinflussen, die Reaktivität und die Faltungs-Entfaltungs-Prozesse von Proteinen ^9,19. Einzelne Aminosäurereste zeigen oft unterschiedliche effektive Aciditäten je nach ihren Standorten in Proteinen. Insbesondere die Reste an den aktiven Zentren befinden zeigen oft deutlich gestört Aciditäten. Ein solches Beispiel ist der Cysteinrest mit Wohnsitz in den aktiven Zentren des Thioredoxin super-Familie von Enzymen ^20,21. Das aktive Zentrum Cystein ist ungewöhnlich sauren im Vergleich zu denen in entfaltete Proteine ^​​3-5. Es wurde vorgeschlagen, dass die Helix-Konformation kann einen wesentlichen Beitrag zur ungewöhnlichen Säure haben. Es gibt umfangreiche experimentelle Untersuchungen über die Säure-Base-Eigenschaften von Peptiden in Lösungen durchgeführt, insbesondere in wässrigen Lösungen ^2,6-8. Die Ergebnisse wurden oft von Lösungsmitteleffekte kompliziert^7. In der Tat sind die meisten der aktiven Stellen in Proteinen in der Nähe des inneren Bereichs in dem Lösungsmittel ^9,10 Wirkungen minimiert befinden.

Um intrinsische Säure-Base-Eigenschaften von Peptiden und Proteinen zu verstehen, ist es wichtig für die Durchführung der Untersuchungen in einer lösungsmittelfreien Umgebung. Hier stellen wir eine Massenspektrometrie-basierte Verfahren zur Bestimmung der Gasphase Säure. Der Ansatz wird als erweiterte Cooks kinetische Methode bezeichnet. Diese Methode wurde erfolgreich in einer Vielzahl von chemischen Systemen zur Bestimmung von verschiedenen thermochemischen Eigenschaften, wie z. B. der Gasphase Säure, die Protonen-Affinität, die Affinität für Metallionen, die Elektronenaffinität und der Ionisierungsenergie ^{11-15 angelegt, 22-26.} Wir haben diese Methode, um die Gas-Phase Aciditäten einer Reihe von Oligo-Cystein und Cystein-Polyalanin Polyglycin Peptide ^17,18,27 bestimmen angewendet. Diese Studien zeigen, dass die N-terminalen Cystein Peptides sind deutlich saurer als die entsprechenden C-terminalen diejenigen. Die hohe Acidität der ersteren sind wahrscheinlich auf die schraubenförmigen Konformationseffekte in dem das Thiolat-Anion stark durch die Wechselwirkung mit der Wendel Makro-Dipol stabilisiert wird. Aufgrund der nicht-flüchtige und thermisch instabil sind Peptide, die kinetische Methode ist es am praktischsten derzeit vorliegenden einigermaßen genaue Säure-Base-thermochemischen Mengen von Peptiden ²⁸ zu erzeugen.

Das allgemeine Schema und die Gleichung mit der kinetischen Verfahren zusammenhängen, sind in 1 gezeigt. Die Bestimmung der Gasphase Säure eines Peptids (AH) mit der Bildung einer Reihe von Protonen-gebundenen Clusteranionen [A • h • A _i] ¯ (oder [A ¯ • H ⁺ • A ¯ _i] ¯), in der Ionenquelle Region des Massenspektrometers, wobei A ¯ A ¯ _i sind die deprotonierte Form des Peptids unddie Referenz-Säuren sind. Die Referenz-Säuren sind organische Verbindungen mit bekannten Gasphase Aciditäten. Die Säuren dienen sollten Strukturen einander ähnlich (jedoch nicht notwendigerweise ähnlich der des Peptids). Die Ähnlichkeit der Strukturen zwischen Referenz-Säuren stellt die Ähnlichkeit der Entropien Deprotonierung unter ihnen. Das Proton-gebundene Cluster Anionen Masse ausgewählt und collisionally aktiviert und anschließend mit dissoziierten Stoßfragmentierung (CID) Experimente, um die entsprechenden monomeren Anionen ergeben, A und A ¯ ¯ _i, mit Geschwindigkeitskonstanten k und k _i, jeweils in Abbildung 1a. Wenn sekundäre Fragmentierungen vernachlässigbar sind, die Fülle Verhältnis der CID-Fragment-Ionen, [A ¯] / [A _i ¯], stellt ein ungefähres Maß für das Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten k / k _i. Unter der Annahme, dass es keine umgekehrte aktivierendenIonensperren sowohl Dissoziationskanäle die CID Produkt Ion Verzweigungsverhältnisse, ln [A ¯] / [A _i ¯], linear auf die Gasphasen-Acidität des Peptids (Δ _Säure H) und diejenigen werden korreliert werden die Referenz-Säuren (Δ _Säure H _i), wie in 1b gezeigt. In dieser Gleichung Δ _Säure H _avg die durchschnittliche Gasphase Säuregehalt der Referenz-Säuren ist, Δ (Δ S) die Entropie Begriff (das kann als konstant angenommen werden, wenn die Referenz-Säuren sind strukturell einander ähnlich) ist, R die universelle Gaskonstante und T _eff die effektive Temperatur des Systems. Die effektive Temperatur ist eine empirische Parameter ist, der mehrere experimentelle Variablen, einschließlich der Kollisionsenergie abhängt.

Der Wert der Gasphase Säure wird erreicht, indem zwei Sätze von thermo-kinetische Diagramme bestimmt. Der erste Satz der OBenthaltenen durch Auftragung ln ([A ¯] / [A _i ¯]) gegen Δ _Säure H _i – Δ _Säure H _avg, wie in Abbildung 4a gezeigt. Lineare Regression wird eine Reihe von geraden Linien mit den Pisten von X = 1 / RT _eff und fängt von Y Ausbeute = – [Δ _Säure H – Δ _Säure H _avg] / RT _eff – Δ (Δ S) / R. Der zweite Satz von Flächen durch Auftragen der resultierenden fängt (Y) aus dem ersten Satz mit den entsprechenden geneigten Flächen (X), wie in 4b gezeigt ist. Lineare Regression erzeugt eine neue Linie mit einer Steigung von Δ _Säure H – Δ _Säure H _avg und ein Abschnitt von Δ (Δ S) / R. Der Wert Δ H _Säure wird dann aus der Steigung erhalten, und die Entropieterm, Δ (Δ S), erhält man ausder Schnittpunkt.

Die Experimente werden unter Verwendung eines Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer eine Schnittstelle mit einer Elektrospray-Ionisations (ESI)-Ionenquelle. Ein schematisches Diagramm des Massenspektrometers ist in Abbildung 2 dargestellt. Die CID Experimente Masse Auswahl der Protonen-bound-Anionen mit dem ersten Quadrupol-Einheit und es ihnen ermöglicht, um Kollisionen mit Argon-Atomen in der Kollision Kammer, die bei einem Druck von etwa 0,5 mTorr gehalten wird zugespielt Eingriff durchgeführt. Die Spaltprodukt Ionen Masse mit dem dritten Quadrupol-Gerät analysiert. Die CID-Spektren werden bei mehreren Kollisionsenergien mit dem m / z-Bereich breit genug, um alle möglichen sekundären Fragmente decken aufgezeichnet. Die CID Produkt Ionenintensitäten indem das Gerät in der gewählten Reaktionstemperatur Monitoring (SRM), in dem die Scan ausgewählten Produkt-Ionen fokussiert wird gemessen. Die CID Experimente werden an vier verschiedenen Kollisionsenergien durchgeführt, entsprechendCenter-of-mass Energien (E _cm) von 1,0, 1,5, 2,0 und 2,5 eV. Die Mitte-der-Masse-Energie wird unter Verwendung der Gleichung: E = E _{Labor cm} [m / (M + m)], wobei E _Labor die Aufprallenergie im Laborsystem ist, m die Masse der Argon und M die Masse des Proton-gebundenen Cluster-Ionen.

In diesem Artikel verwenden wir die Oligo-Ala ₃ CysNH ₂ (A ₃ CH) als Vorbild Verbindung. Der C-Terminus amidiert ist und die Thiolgruppe (SH) des Cysteins wird die saure Website. Die Auswahl eines geeigneten Referenz Säuren ist von entscheidender Bedeutung für die erfolgreiche Messung der Gasphase Säure. Die ideale Nachschlagewerk Säuren sind strukturell ähnlich (miteinander) organische Verbindungen mit etablierten Gasphase Säurewerte. Die Säuren dienen sollte Säure Werte nahe, dass der Peptide. Für das Peptid A ₃ CH, halogenierte sechs carbonsäurec Säuren werden als Referenz-Säuren gewählt. Die sechs Referenz Säuren sind Chloressigsäure (MCAH) Bromessigsäure (MBAH), Difluoressigsäure (DFAH), Dichloressigsäure (DCAH), dibromoacetic Säure (DBAH) und Trifluoressigsäure (TFAH). Zwei von ihnen, wird DFAH und MBAH, verwendet werden, um das Protokoll zu veranschaulichen.

Protocol

1. Vorbereitung der Musterlösungen Bereiten Sie zuerst die Stammlösungen des Peptids und die sechs Referenz Säuren Verwendung eines gemischten Lösungsmittels aus Methanol und Wasser in einem Volumenverhältnis 1:1. Die Stammlösungen sollte eine Konzentration von etwa 10 -3 M. Man wiegt 1 mg des festen peptid-Probe, A 3 CH, in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und 1,0 ml Lösungsmittelgemisch aus Methanol und Wasser, und Mischen mit einem Vortex. Abwiegen 1 mg Difluo…

Representative Results

Die CID Bracketing Experimente liefern Informationen über die relativen Acidität des Peptids im Vergleich zu den ausgewählten Referenz-Säuren. Zwei repräsentative CID-Spektren des Peptids (A 3 CH) mit zwei Referenz-Säuren, DFAH und MBAH, sind in Abbildung 3 dargestellt. In Fig. 3a ist der Ionenhäufigkeit (Peakhöhe) des Peptid-Ion ist schwächer als die des DFA ¯ und in 3b ist die Ionenhäufigkeit des Peptids Ionen stärker als die des MBA ¯. Die beiden Spektren zei…

Discussion

Die erfolgreiche Messung der Gasphase Säuregehalt eines Peptids weitgehend beruht auf der Auswahl geeigneter Referenz Säuren. Die ideale Nachschlagewerk Säuren sind strukturell ähnliche organische Verbindungen mit etablierten Gasphase Säurewerte. Die Referenz-Säuren sollten ähnliche Strukturen zueinander haben. Dadurch wird eine ähnliche Entropie Deprotonierung für jeden der Referenz-Säuren in dem Satz. Die Referenz-Säuren sollten Säurewerte nahe an denen der Peptide. Für kürzere Cystein enthaltenden Oligo…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Mass Spectrometer	Varian	1200 L and 320 L
Chloroacetic acid	Sigma-Aldrich	402923
Bromoacetic acid	Sigma-Aldrich	B56307
Difluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	142859
Dichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	D54702
Dibromoacetic acid	Sigma-Aldrich	242357
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508