Laser toegebrachte schade van zebravis Embryonale skeletspier

Summary

De werkwijze omvat de hier gepresenteerde precieze schade van levende zebravis embryo's met hoge energie laserpulsen en de analyse van deze letsels en hun herstel met de tijd. We laten ook zien hoe genetisch enkel label of groepen van skeletspiercellen kunnen worden gevolgd tijdens en na de laser-licht veroorzaakte schade.

Abstract

Verschillende experimentele benaderingen zijn gebruikt in de muis om spierblessure veroorzaken, met als doel om spieren regeneratie te bestuderen, met inbegrip van myotoxin injecties (bupivacaïne, cardiotoxine of notexin), spier transplantaties (denervatie-devascularization geïnduceerde regeneratie), intensieve lichaamsbeweging, maar ook muizen spierdystrofie modellen zoals de mdx muis (voor een overzicht van deze benaderingen zie ^1). In zebravis, genetische benaderingen zijn mutanten die spierdystrofie fenotypen (zoals runzel ² of sapje ³⁾ vertonen en antisense oligonucleotide morfolino dat de expressie van dystrofie-geassocieerde genen ⁴ blokkeren. Bovendien chemische benaderingen mogelijk, bijv. met Galanthamine, een chemische verbinding remmen acetylcholinesterase, hetgeen resulteert in hypercontraction, wat uiteindelijk leidt tot spierdystrofie ^5. Echter, genetische en farmacologische benaderingen generally van invloed op alle spieren binnen een individu, terwijl de omvang van fysiek toegebracht letsel gemakkelijker in ruimte en tijd ¹ gecontroleerd. Gelokaliseerde lichamelijk letsel kan de beoordeling van de contralaterale spier als een interne controle. Inderdaad hebben we onlangs gebruikte laser gemedieerde ablatie naar skeletspier regeneratie te bestuderen in de zebravis embryo ^6, terwijl een andere groep onlangs gemeld het gebruik van een twee-foton laser (822 nm) zeer lokaal beschadigd plasmamembraan van embryoethische zebravis spier cellen ^7.

Hier rapporteren we een methode voor het gebruik van de Micropoint laser (Andor Technology) zorgt voor skeletspieren celschade in de zebravis embryo. De Micropoint laser is een hoge energie laser die geschikt is voor doelwitcel ablatie bij een golflengte van 435 nm. De laser is verbonden met een microscoop (in onze setup, een optische microscoop van Zeiss) zodanig dat de microscoop worden tegelijkertijd fof scherpstellen het laserlicht op het monster en visualiseren van de effecten van de verwonding (helderveld of fluorescentie). De parameters voor het regelen van laserpulsen omvatten golflengte, intensiteit en aantal pulsen.

Door de transparantie en externe embryonale ontwikkeling, het zebravis embryo zeer vatbaar voor zowel laser geïnduceerde schade en voor het bestuderen van het daaropvolgende herstel. Tussen 1 en 2 dagen na de bevruchting, somitic skeletspiercellen geleidelijk ondergaan rijping van anterior naar vanwege de progressie van somitogenesis posterior van de stam naar staart ^{8, 9.} Op deze stadia, embryo spontaan trillen en initiëren zwemmen. De zebravis is onlangs erkend als een belangrijk vertebrate modelorganisme voor de studie van weefselregeneratie, met vele soorten weefsels (hart, neuronale, vasculaire etc.) kunnen worden geregenereerd na letsel in de volwassen zebravis ^{10, 11.}

Protocol

1. Labeling Losse Cellen Injecteer eencellige embryo's met een plasmide dat codeert voor GFP of GFP-fusie-eiwit onder controle van een β-actine promoter. Tijdens de ontwikkeling wordt GFP vervolgens uitgedrukt in een mozaïek mode. Hier gebruikten wij het ​​transgene construct Tg [β-actine: α-actinine-GFP], welke plaatsen de α-actinine-GFP fusie-eiwit onder controle van de β-actine promoter. 2. Embryo Embedding <l…

Representative Results

Laser-gemedieerde schade werd uitgevoerd op geïmmobiliseerde 1 dag-oude embryo's. Zoals getoond in figuur 1 kan een enkele laser pulsen genereren een kleine wond, herkenbaar aan de beschadigde, opgerold Actin-rijke myofibrillen die normaal gespannen tussen de somiet grenzen. Een groter aantal laserpulsen zal echter leiden tot een massief blok beschadigd somiet, waar de meeste myofibrillen worden vernietigd. Toch kunnen we letterlijk zien dat "tijd alle wonden heelt", met kleine blessures …

Discussion

Laser-gemedieerde schade is een krachtige methode voor het toebrengen van wonden van een gewenste grootte door ablatie cellen om regeneratie te bestuderen onder gecontroleerde omstandigheden in de zebravis embryo. Met name kunnen cellen nauwkeurig worden gericht (figuur 2) en de schade-gebied en timing worden geregeld. Vervolgens worden de verwonding en regeneratieprocessen gemakkelijk gevolgd, opgenomen (figuur 3) en geanalyseerd (Figuur 1). Hoewel de laser goed gerich…

Materials

Heating block
Pair #5 forceps	Dumont
Glass slides	Menzel		76 x 26 mm
Coverslips	Roth		50 x 24 mm #1
Petroleum jelly
Stereomicroscope	Leica		MZFLIII
Micropoint laser	Andor Technology
Fluorescence microscope	Zeiss		Axioplan II
Metamorph software	Molecular devices
			Reagents Low-melting point agarose ( #50081, Lonza) Tricaine stock solution: 400 mg Tricaine (#A-5040, Sigma-Aldrich ) / 100 ml dH2O pH 9.0 E3 medium (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)