Laser-infligé des blessures de poisson zèbre muscle squelettique embryonnaire

Summary

La méthode présentée ici comprend la blessure précise des embryons de poisson zèbre en direct avec des impulsions laser de haute énergie et l'analyse subséquente de ces blessures et leur récupération avec le temps. Nous montrons aussi comment génétiquement étiquetés simple ou groupes de cellules musculaires squelettiques peuvent être suivis pendant et après la lumière laser dommages induits.

Abstract

Diverses approches expérimentales ont été utilisées dans la souris pour induire une lésion musculaire dans le but d'étudier la régénération des muscles, y compris les injections myotoxine (bupivacaïne, cardiotoxine ou notexin), les transplantations musculaires (dénervation-dévascularisation régénération induite), l'exercice intensif, mais aussi des modèles murins atteints de dystrophie musculaire tels que la souris mdx (pour une revue de ces approches voir ^1). Chez le poisson zèbre, les approches génétiques comprennent des mutants qui présentent des phénotypes dystrophie musculaire (tels que runzel ² ou sapje ³⁾ et antisens morpholinos oligonucléotidiques qui bloquent l'expression des gènes associés à la dystrophie ^4. En outre, les approches chimiques sont également possibles, par exemple avec galanthamine, une inhibition de l'acétylcholinestérase composé chimique, ce qui entraîne hypercontraction, ce qui conduit finalement à la dystrophie musculaire ^5. Approches Cependant, génétiques et pharmacologiques généralement affecter tous les muscles dans un individu, alors que la gravité des blessures infligées sont physiquement plus facile à contrôler spatialement et temporellement ^1. Localisée blessure physique permet l'évaluation de muscle controlatéral comme contrôle interne. En effet, nous avons récemment utilisé laser médiée par ablation cellulaire pour étudier la régénération du muscle squelettique chez l'embryon de poisson zèbre ^6, tandis qu'un autre groupe a récemment rapporté l'utilisation d'un laser à deux photons (822 nm) à des dommages très localement la membrane plasmique du muscle du poisson zèbre individu embryonnaire cellules ^7.

Ici, nous présentons une méthode pour utiliser le laser micropoint (Andor Technology) pour une lésion musculaire squelettique cellulaire dans l'embryon de poisson zèbre. Le laser à micropointes est un laser à haute énergie, qui est adapté pour l'ablation de cellules ciblée à une longueur d'onde de 435 nm. Le laser est relié à un microscope (dans notre configuration, à partir d'un microscope optique Zeiss) de telle sorte que le microscope peut être utilisé à la fois fou focaliser la lumière laser sur l'échantillon et pour visualiser les effets de la blessure (fond clair ou fluorescence). Les paramètres de commande comprennent des impulsions laser de longueur d'onde, de l'intensité et du nombre d'impulsions.

En raison de sa transparence et externes du développement embryonnaire, l'embryon du poisson zèbre se prête très bien à la fois induite par laser blessures et pour l'étude de la reprise ultérieure. Entre 1 et 2 jours post-fécondation, les cellules musculaires squelettiques somitiques subir une maturation progressive d'avant en arrière en raison de la progression de somitogenèse du tronc à la queue ^{8, 9.} A ces stades, les embryons se contracter spontanément et de lancer la natation. Le poisson-zèbre a récemment été reconnue comme un organisme modèle vertébré important pour l'étude de la régénération des tissus, comme de nombreux types de tissus (cardiaques, neuronales, vasculaires, etc) peuvent être régénérés après une blessure chez l'adulte poisson zèbre ^{10, 11.}

Protocol

1. Étiquetage cellules isolées Injecter embryons au stade une cellule-avec un plasmide codant pour la GFP ou de toute protéine de fusion GFP-sous le contrôle d'un promoteur β-actine. Au cours du développement, la GFP est alors exprimée d'une façon mosaïque. Ici, nous avons utilisé la construction transgénique Tg [β-actine: α-actinine-GFP], ce qui place la protéine de fusion α-actinine-GFP sous le contrôle du promoteur β-actine. <p class="jove_titl…

Representative Results

Blessures laser à médiation a été réalisée sur immobilisées 1 jour embryons âgés. Comme le montre la figure 1, un peu impulsions laser peut générer une petite plaie, facilement reconnaissable par les endommagés, enroulés, actine riches en myofibrilles qui sont normalement tendus entre les limites de somites. Un plus grand nombre d'impulsions laser va cependant conduire à un bloc somite gravement endommagés, où la plupart des myofibrilles sont détruits. Néanmoins, nous pouvons litt?…

Discussion

Laser à médiation blessure est une méthode puissante pour infliger des blessures d'une taille désirée par l'ablation des cellules afin d'étudier la régénération dans des conditions contrôlées dans l'embryon de poisson zèbre. Notamment, les cellules peuvent être ciblées avec précision (figure 2) et à la fois le domaine des blessures ainsi que le calendrier peut être commandé. Par la suite, le site de la lésion et les processus de régénération sont facilement contrôl…

Materials

Heating block
Pair #5 forceps	Dumont
Glass slides	Menzel		76 x 26 mm
Coverslips	Roth		50 x 24 mm #1
Petroleum jelly
Stereomicroscope	Leica		MZFLIII
Micropoint laser	Andor Technology
Fluorescence microscope	Zeiss		Axioplan II
Metamorph software	Molecular devices
			Reagents Low-melting point agarose ( #50081, Lonza) Tricaine stock solution: 400 mg Tricaine (#A-5040, Sigma-Aldrich ) / 100 ml dH2O pH 9.0 E3 medium (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)